1. Makita ang pagsuyop sa RNA nga solusyon
Ang pagsuyup sa 280, 320, 230, ug 260 nm nagrepresentar sa mga kantidad sa nucleic acid, background (solusyon sa turbidity), konsentrasyon sa asin, ug organikong butang sama sa protina, matag usa.Kasagaran tan-awon lang ang OD260/OD280 (Ratio, R).Kung ang 1.8 ~ 2.0, gihunahuna namon nga ang kontaminasyon sa protina o uban pang organikong butang sa RNA mahimong matugotan, apan kinahanglan nga matikdan nga kung gigamit ang Tris ingon buffer aron mahibal-an ang pagsuyup, ang kantidad sa R mahimong labi pa sa 2 (sa kasagaran kini kinahanglan nga <2.2).Kung R<1.8, ang polusyon sa protina o uban pang organikong butang sa solusyon mas klaro, ug ang kapalaran sa RNA mahimong matino sumala sa mga panginahanglanon.Kung R> 2.2, kini nagpasabut nga ang RNA na-hydrolyzed sa usa ka nucleic acid.
2.Electrophoric pattern sa RNA
Kasagaran, ang denaturing gel gigamit alang sa RNA electrophoresis, apan kung kini alang lamang sa pag-ila sa kalidad sa RNA, ang denaturing gel dili kinahanglan, ug ang ordinaryong agarose gel mahimong magamit.Ang katuyoan sa electrophoresis mao ang pag-ila sa integridad sa 28S ug 18S nga mga banda ug sa ilang ratio, o ang integridad sa mRNA smear.Kasagaran, kung ang 28S ug 18S nga mga banda hayag, tin-aw, ug hait (nagtumong sa mga ngilit sa mga banda klaro), ug ang kahayag sa 28S labaw pa sa doble sa 18S nga banda, among gikonsiderar ang kalidad sa RNA nga maayo.
Ang naa sa ibabaw mao ang duha nga mga pamaagi nga sagad natong gigamit, apan walay bisan usa niining duha ka mga pamaagi ang klaro nga makasulti kanato kung adunay nahabilin nga RNase sa solusyon sa RNA.Kung adunay gamay kaayo nga kantidad sa RNase sa solusyon, lisud alang kanato nga makit-an kini sa pamaagi sa ibabaw, apan kadaghanan sa mga sunod-sunod nga reaksyon sa enzymatic gihimo sa ibabaw sa 37 degree ug sa dugay nga panahon.Niining paagiha, kung adunay gamay kaayo nga kantidad sa RNase sa solusyon sa RNA, nan adunay usa ka angay nga palibot ug oras sa pagdula sa ilang papel sa sunod nga mga eksperimento, ug siyempre ang eksperimento mahimong tugnaw niining panahona.Sa ubos gipaila namon ang usa ka pamaagi nga makakumpirma kung adunay nahabilin nga RNase sa solusyon sa RNA.
3. Pagsulay sa pagpreserba sa kainit
Sumala sa sample nga konsentrasyon, pagdrowing og duha ka 1000 ng RNA gikan sa RNA nga solusyon ug idugang kini sa usa ka 0.5 ml nga centrifuge tube, ug dugangan kini og pH 7.0 Tris buffer ngadto sa total nga volume nga 10 ul, ug dayon i-seal ang cap sa tubo.Ibutang ang usa niini sa usa ka kanunay nga temperatura nga kaligoanan sa tubig sa 70 ° C ug painit kini sulod sa 1 ka oras.Ang laing bahin gitipigan sa usa ka -20°C nga refrigerator sulod sa 1 ka oras.Kung nahuman na ang oras, kuhaa ang duha nga mga sample para sa electrophoresis.Human makompleto ang electrophoresis, itandi ang electrophoretic bands sa duha.Kung ang mga banda sa duha managsama o wala’y hinungdan nga kalainan (siyempre, ang ilang mga banda nakatagbo usab sa mga kondisyon sa pamaagi 2), kini nagpasabut nga wala’y nahabilin nga kontaminasyon sa RNase sa solusyon sa RNA, ug ang kalidad sa RNA maayo kaayo.Sa kasukwahi, kung ang sample nga gilumlum sa 70 ° C nagpakita sa dayag nga pagkadaut, kini nagpakita nga adunay kontaminasyon sa RNase sa solusyon sa RNA.
2 Mga pamaagi sa eksperimento ug mga teknik alang sa pagkuha sa RNA
Ang mga problema nga kanunay natong masugatan sa pagkuha sa RNA mao ang: (1) RNA yield ubos;(2) Ang RNA adunay grabe nga polusyon sa asin;(3) Ang RNA adunay seryoso nga polusyon sa organikong solvent;(4) sample degradation ug uban pang mga problema
1. Kasagarang gigamit nga total RNA extraction reagents
Ang guanidine isothiocyanate nga pamaagi ug ang Trizol nga pamaagi mao ang labing kasagarang gigamit nga mga pamaagi alang sa pagkuha sa kinatibuk-ang RNA gikan sa mga tisyu sa mananap ug mga selula sa mananap.Ilabi na nga angay alang sa gagmay nga mga sample ug mga tisyu nga labi ka lisud nga makuha, sama sa pagkuha sa kinatibuk-ang RNA gikan sa panit sa koneho ug tisyu sa connective sa hayop;Dugang pa, ang Trizol, isip usa ka kinatibuk-ang katuyoan nga lysis reagent, mahimo usab nga gamiton alang sa pagkuha sa mga tisyu sa tanum, bakterya, fungi ug uban pang mga tisyu.Alang sa mga tisyu sa tanum nga adunay polysaccharides ug polyphenols, sama sa camellia oleifera, dahon sa tsa, rapeseed, ug uban pa, ang pamaagi sa CTAB mahimo usab nga gamiton aron makuha ang kinatibuk-ang RNA.
Ingon usa ka naandan nga pamaagi, ang pamaagi sa doble nga kolum popular usab tungod sa normal nga operasyon sa temperatura, dili kinahanglan nga idugang ang RNase, ug luwas-walay chloroform, phenol ug uban pang mga organikong reagents alang sa pagkuha.(girekomenda nga mga produkto )
2. Pagkuha sa kinatibuk-ang RNA gikan sa mga tisyu sa hayop
(1) Sulayi sa pagpili sa lab-as nga tissue, kon kini dili presko (mas maayo sa sulod sa tulo ka bulan - 80 ℃ refrigerator o frozen sa liquid nitrogen. Sa diha nga pagputol tissue, ayaw pagputol direkta sa lawak temperatura, siguroha nga Ibutang kini sa ice box, pagsulay sa paglikay sa balik-balik nga kaging ug thawing.
(2) Gamita ang limpyo nga gunting ug sipit sa pagputol sa usa ka gamay nga piraso sa tisyu, pagsulay sa pagputol sa sentro nga bahin sa tisyu sa dihang magputol sa sample, o una nga putlon ang dako nga piraso sa tisyu gikan sa tunga, ug dayon putlon ang sample sa presko nga posisyon sa paghiwa.Ang gikuha nga tisyu kinahanglan nga bug-os nga giputol, ibutang ang ginunting nga tisyu sa usa ka EP tube nga walay RNase, idugang ang lysate, ang ginunting nga tisyu kinahanglan nga bug-os nga maladlad sa lysate, ug mag-andam alang sa homogenization.
(3) Para sa normal nga mga tisyu, pilia ang mung bean-sized nga mga tisyu (30-60 mg) para sa homogenization.Kung ang mga tisyu adunay daghang protina, tambok, o dasok nga fibrous nga mga tisyu sama sa atay, angay nga dugangan o pakunhuran ang gidaghanon sa giputol nga mga tisyu (opsyonal) Pilia ang 10 ~ 20 mg).
(4) Kung ang kaunoran sa isda, karne sa hipon, sakyan ug uban pang mga tisyu nga adunay taas nga sulud sa tubig makuha, ang gidaghanon sa sample kinahanglan nga madugangan (girekomenda nga 100-200 mg).
(5) Kung gitugutan sa mga kondisyon, ang tisyu sa hayop mahimong direktang makuha human ma-homogenized sa usa ka high-passage tissue homogenizer, kung wala’y ingon nga kagamitan.
(6) Ang RNA nga nakuha human sa kataposang pagkuha kinahanglang ibutang dayon sa kahon sa yelo aron makunhuran ang pagkadaot sa RNA.
3. Animal cell RNA extraction
(1) Suspension cells: direkta nga centrifuge ug isalikway ang medium, hugasi gamit ang sterile PBS sa 1-2 ka beses, dayon suspindihon sa usa ka angay nga kantidad sa PBS, ug dayon idugang ang lysate alang sa lysis.Ayaw idugang ang lysate direkta ngadto sa precipitated cells human sa hingpit nga paglabay sa likido.Kini maoy hinungdan nga ang histone package nga gipagawas human ang lysed cells sa gawas nga layer motapot sa gawas sa precipitated cells, sa ingon limitahan ang kontak sa mga cell sulod sa pellet sa lysate., nga miresulta sa dili kompleto nga cell lysis ug pagkunhod sa ani sa RNA.
(2) Mga selula nga semi-adherent o dili hugot nga nagsunod: Human ilabay ang medium, hugasi gamit ang PBS sulod sa 1-2 ka beses, dayon direkta nga mosuhop sa tukma nga gidaghanon sa PBS ug huypa ang culture dish gamit ang pipette o pusil aron huypon ang mga selula, ug ibalhin kini ngadto sa RNA-free nga mga selula.Idugang ang lysate sa EP tube sa enzyme alang sa pagkuha.
(3) Adherent cells: kinahanglan nga tunawon una sa trypsin, dayon kolektahon sa RNase-free EP tubes, centrifuged aron makuha ang supernatant, gihugasan 1-2 ka beses sa PBS aron makuha ang sobra nga trypsin, ug i-resuspended sa tukmang kantidad sa PBS Unya ipadayon ang lakang sa pagkuha.
4. Pagkuha sa RNA sa tanum
Ang mga tisyu sa tanum dato sa mga phenolic compound, o dato sa polysaccharides, o adunay pipila nga wala mailhi nga mga sekondaryang metabolite, o adunay taas nga kalihokan sa RNase.Kini nga mga substansiya hugot nga gihiusa sa RNA human sa cell lysis aron maporma ang dili matunaw nga mga komplikado o colloidal precipitates, nga lisud tangtangon.Busa, kung magkuha kita og tisyu sa tanum, kinahanglan nga mopili kita og usa ka kit alang sa mga tanum.Ang lysate sa kit epektibo nga makasulbad sa mga problema sa dali nga oksihenasyon sa polyphenols ug pagbulag sa mga polysaccharide compound ug nucleic acid.
(Para sa polysaccharide polyphenol plant RNA extraction, girekomenda nga mga produkto:
(1) Ang panit, pulp, liso, dahon, ug uban pa sa tanom kinahanglang bug-os nga magaling sa mortar.Atol sa proseso sa paggaling, ang likido nga nitroheno kinahanglan nga mapuno sa oras aron malikayan ang pagtunaw sa sample.Ang sampol sa yuta kinahanglan nga dali nga idugang sa lysate ug matay-og aron malikayan ang pagkadaot sa RNA.
(2) Alang sa mga sample nga puno sa fiber sama sa mga dahon sa bugas ug trigo, ang gidaghanon sa pagkuha kinahanglan nga angay nga pagkunhod, kung dili ang tissue grinding ug lysis dili kompleto, nga moresulta sa usa ka ubos nga ani sa nakuha nga RNA.
(3) Alang sa mga tisyu sa tanum nga adunay taas nga sulud sa tubig, sama sa prutas nga granada, prutas nga pakwan, prutas nga peach, ug uban pa, ang gidak-on sa sample kinahanglan nga madugangan (100-200 mg opsyonal).
(4) Ang mga tisyu sa tanom, sama sa dahon sa tanom, rhizome, gahi nga prutas ug uban pang materyales kasagarang girekomendar nga gamiton ang liquid nitrogen aron hingpit nga lusongon ang mga sangkap sa mortar, ug dayon mopadayon sa lakang sa pagkuha.Ang naandan nga mga homogenizer sa tisyu mahimong dili epektibo sa pag-homogenize sa mga tisyu sa tanum, ug kasagaran dili girekomenda.
5. Mga panagana alang sa pagkuha sa RNA
(1) Ang mga sample sa tisyu kinahanglan nga presko kutob sa mahimo aron malikayan ang balikbalik nga pagyelo ug pagtunaw.
(2) Ang tisyu kinahanglan nga bug-os nga gigaling sa panahon sa pagkuha, ug ang gidaghanon sa tisyu kinahanglan dili gamay ra, labi na ang sobra.
(3) Ang igo nga oras sa paglumlum kinahanglan ihatag pagkahuman sa pagdugang sa lysate aron hingpit nga ma-lyse ang sample.
(4) Kung gigamit ang Trizol nga pamaagi alang sa pagkuha, ang prinsipyo sa pagsuhop sa supernatant pagkahuman sa stratification mao ang "mas gusto nga makaginhawa nga gamay kaysa makahawa nga labi pa", ug kinahanglan dili makuha sa tunga nga layer, kung dili kini hinungdan sa grabe nga kontaminasyon sa genomic DNA.
(5) Sa paghugas, ang panghugas nga likido kinahanglan nga bug-os nga mosulod sa palibot sa bungbong sa tubo aron masiguro ang hingpit nga paghugas.
(6) Alang sa pamaagi sa pagkuha sa kolum, dugang sa pagtangtang sa kolum pagkahuman sa paghugas, ang kolum sa adsorption kinahanglan usab nga ibutang sa usa ka ultra-limpyo nga bangko ug huypan sulod sa 5-10 ka minuto aron hingpit nga ma-evaporate ang organikong solvent sa pagkauga.
(7) Sa katapusan nga elution sa kolum nga pamaagi, human sa pagdugang sa DEPC nga tubig, kini kinahanglan nga incubated alang sa 3-5 minutos, o ang DEPC nga tubig kinahanglan nga gipainit sa 60 ° C sa abante aron sa pagdugang sa elution abot.Sa tradisyonal nga Trizol cleavage ug isopropanol precipitation nga pamaagi, ang katapusan nga RNA natunaw sa tubig sa DEPC, mao nga ang usa ka tukma nga panahon kinahanglan nga ihatag alang sa dissolution, ug ang ubos sa centrifuge tube kinahanglan nga padayon nga hinuyop sa usa ka pipette tip.
3 TMga hinungdan ug solusyon alang sa ubos nga konsentrasyon sa RNA / dili maayo nga kalidad
1. Ubos ra kaayo ang abot
Ang gikuha nga sample ubos kaayo, ang kinatibuk-ang kantidad dili igo, o ang gikuha nga sample sobra ra ug ang lysis dili kompleto;ang tisyu o mga selula nga adunay angay nga kalidad kinahanglan nga gamiton alang sa pagkuha, ang pre-treatment sa sample kinahanglan nga buhaton nga maayo, ug ang lysis kinahanglan nga igo.
2. Mga residu sa genome
Kung gikuha pinaagi sa Trizol nga pamaagi, kung ang supernatant gisuyop sa tunga nga layer pagkahuman sa layering, ang grabe nga kontaminasyon sa genome ang hinungdan;dugang nga pag-atiman kinahanglan nga gikuha sa diha nga layering sa paglikay sa pagsuyop ngadto sa tunga-tunga nga layer.Kung ang pamaagi sa kolum gigamit alang sa pagkuha, usa ka kit nga adunay DNase I mahimong mapili alang sa pagkuha.Ang nucleic acid nga na-adsorb sa lamad direkta nga natunaw sa DNase I, nga makapakunhod pag-ayo sa mga residu sa DNA.
3. Pagkadaot sa RNA
Mahimong ang pagkadaot sa gikuha nga sample mismo, o ang pagkadaot nga gipahinabo sa proseso sa pagkuha;kutob sa mahimo, ang mga presko nga sample kinahanglan nga gamiton alang sa RNA extraction, ug ang nakolekta nga mga sample kinahanglan nga tipigan sa liquid nitrogen o -80 °C refrigerator sa panahon, ug ang balik-balik nga pagyelo ug pagtunaw kinahanglan nga likayan.Ang mga libre nga tip sa RNase/DNase, mga tubo sa centrifuge ug uban pang mga materyales kinahanglan gamiton sa proseso sa pagkuha sa RNA.Ang proseso sa pagkuha kinahanglan nga paspas kutob sa mahimo.Ang gikuha nga RNA kinahanglan ibutang sa usa ka kahon sa yelo ug tipigan sa -80 sa oras.Kung ang gikuha nga RNA kinahanglan nga makit-an sa gel electrophoresis, ang electrophoresis kinahanglan nga himuon dayon pagkahuman sa pagkuha, ug ang buffer sa electrophoresis kinahanglan pulihan sa usa ka bag-ong giandam.
4. Asin ug organic solvent residues
Ang mga extraction reagents adunay phenol ug guanidine salts, ug ang washing solution adunay ethanol.Atol sa proseso sa pagkuha, ang lysate dili hingpit nga masuhop ug ilabay, ug ang solusyon sa paghugas dili hingpit nga mamala.Ang nahabilin nga mga asin ug mga organikong solvent makadaot sa sunod nga reverse transcription ug PCR.Nagkalainlain nga ang-ang sa pagdili, mao nga ang tissue lysate kinahanglan nga bug-os nga gikuha sa panahon sa proseso sa pagkuha, ug ang paghugas kinahanglan nga igo aron ang naglibot nga mga bongbong sa tubo mahugasan.Dugang pa, ang tubo gihaw-as ug gihuyop usa ka kinahanglanon nga lakang, nga labi nga makunhuran ang nahabilin sa organikong butang.
Para sa dugang nga impormasyon bahin sa RNA extraction, palihug sunda ang among website:
www.foreivd.com para sa dugang nga impormasyon.
Oras sa pag-post: Dis-01-2022
