Overview
Paspas nga pag-ila sa mga tanum nga transgenic
Text/Tong Yucheng
Eksperimental nga operasyon/Han Ying
Editor/Wen Youjun
Mga Pulong/1600+
Gisugyot nga oras sa pagbasa/8-10 ka minuto
Paspas nga pag-ila sa mga tanum nga transgenic
Isip usa ka bag-o sa laboratoryo, dili maayo nga trabaho ang pag-screen sa mga positibo nga tanum gikan sa usa ka hugpong sa mga tanum nga adunay gamay nga rate sa pagkakabig.Una, ang DNA kinahanglan nga makuha gikan sa daghang mga sample sa usa-usa, ug dayon ang mga langyaw nga gene ma-detect sa PCR.Bisan pa, ang mga resulta kanunay nga mga blangko ug mga banda nga adunay pipila nga mga butang usahay, apan imposible nga mahibal-an kung adunay wala’y nakit-an nga mga nakit-an o sayup nga pag-ila..Wala ba kaayoy mahimo ang pag-atubang sa ingon nga proseso ug mga resulta sa eksperimento?Ayaw kabalaka, ang igsoon nagtudlo kanimo kung giunsa ang pag-screen sa mga positibo nga tanum nga transgenic nga dali ug tukma.
Lakang 1: Desinyo nga detection primers
Tinoa ang endogenous gene ug exogenous gene nga mamatikdan sumala sa sample nga sulayan, ug pagpili og representante nga 100-500bp sequence sa gene para sa primerong disenyo.Ang maayo nga mga primer makasiguro sa pagkatukma sa mga resulta sa pag-ila ug pagpamubo sa oras sa pag-ila (tan-awa ang apendise alang sa kasagarang gigamit nga mga primera sa detection).
Mubo nga sulat:
Ang bag-ong gidesinyo nga mga primera kinahanglan nga ma-optimize ang mga kondisyon sa reaksyon ug pamatud-an ang katukma, katukma, ug limitasyon sa pagkakita sa detection sa dili pa ipahigayon ang dinagkong pagkakita.
Lakang 2:Paghimo og eksperimento nga protocol
Positibo nga pagkontrol: Gamita ang giputli nga DNA nga adunay target nga tipik isip template aron mahibal-an kung normal ba ang sistema ug kondisyon sa reaksyon sa PCR.
Negatibo/blangko nga pagkontrol: Paggamit ug DNA template o ddH2O nga wala maglangkob sa target nga tipik ingon usa ka template aron mahibal-an kung adunay gigikanan sa kontaminasyon sa sistema sa PCR.
Internal nga reference control: gamita ang primer/probe nga kombinasyon sa endogenous gene sa sample nga sulayan sa pagtimbang-timbang kon ang template mahimong mamatikdan sa PCR.
Mubo nga sulat:
Ang positibo, negatibo/blangko nga mga kontrol ug internal nga kontrol nga mga kontrol kinahanglan itakda alang sa matag pagsulay aron sa pagtimbang-timbang sa kabalido sa mga resulta sa eksperimento.
Lakang 3: Pagpangandam sa eksperimento
Sa wala pa gamiton, tan-awa kung parehas nga gisagol ang solusyon.Kung makit-an ang ulan, kini kinahanglan nga matunaw ug isagol sumala sa mga panudlo sa dili pa gamiton.Ang 2×PCR mix kinahanglang ipa-pipette ug balik-balik nga isagol sa micropipette sa dili pa gamiton aron malikayan ang dili patas nga pag-apod-apod sa ion.
Mubo nga sulat:
Kuhaa ang mga instruksyon ug basaha kini pag-ayo, ug paghimo og mga pagpangandam sa dili pa ang eksperimento sa hugot nga pagsunod sa mga instruksyon.
Lakang 4: Pag-andam sa PCR reaction system
Sumala sa eksperimento nga protocol, isagol ang mga primer, H2O, 2×PCR mix, centrifuge ug iapud-apod kanila sa matag reaksyon tube.
Mubo nga sulat:
Alang sa dinagko o dugay nga pagsulay, girekomenda nga mogamit usa ka sistema sa reaksyon sa PCR nga adunay sulud nga UNG enzyme, nga epektibo nga makalikay sa kontaminasyon sa aerosol tungod sa mga produkto sa PCR.
Lakang 5: Idugang ang template sa reaksyon
Gamit ang teknolohiya sa Direct PCR, wala’y kinahanglan alang sa makapakapoy nga proseso sa pagputli sa nucleic acid.Ang sample template mahimong andamon sulod sa 10 minutos ug idugang sa katugbang nga PCR reaction system.
Mubo nga sulat:
Ang pamaagi sa Lysis adunay mas maayo nga epekto sa pagkakita, ug ang nakuha nga produkto mahimong magamit alang sa daghang mga reaksyon sa pagkakita.
5.1: Direktang PCR sa mga dahon
Sumala sa gidak-on sa hulagway sa manwal, guntinga ang tisyu sa dahon nga adunay diyametro nga 2-3mm ug ibutang kini sa PCR reaction system.
Pahinumdom: Siguruha nga ang mga tipik sa dahon hingpit nga naunlod sa solusyon sa reaksyon sa PCR, ug ayaw idugang ang sobra nga tisyu sa dahon.
5.2: Pamaagi sa lysis sa dahon
Guntinga ang tisyu sa dahon nga adunay diyametro nga 5-7mm ug ibutang kini sa usa ka centrifuge tube.Kung gipili nimo ang hamtong nga mga dahon, palihug likayi ang paggamit sa mga tisyu sa panguna nga ugat sa dahon.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ngadto sa usa ka centrifuge tube aron sa pagsiguro nga ang lysate mahimong hingpit nga ituslob sa dahon tissue, ibutang kini sa usa ka thermal cycler o sa usa ka metal nga kaligoanan, ug lyse sa 95°C alang sa 5-10 minutos.
Idugang ang 50ul Buffer P2 neutralization solution ug isagol nga maayo.Ang resulta nga lysate mahimong gamiton isip template ug idugang sa PCR reaction system.
Mubo nga sulat: Ang kantidad sa template kinahanglan nga tali sa 5-10% sa PCR system, ug dili molapas sa 20% (pananglitan, sa 20μl PCR system, idugang ang 1-2μl sa lysis buffer, dili molapas sa 4μl).
Lakang 6: Reaksyon sa PCR
Human sa centrifuging sa PCR reaction tube, ibutang kini sa usa ka PCR instrument para sa amplification.
Mubo nga sulat:
Ang reaksyon naggamit sa non-purified template para sa amplification, mao nga ang gidaghanon sa amplification cycle maoy 5-10 pa ka cycle kay sa paggamit sa purified DNA template.
Lakang 7: Electrophoresis detection ug resulta analysis
M:100bp DNA Ladder
1\4: Giputli nga pamaagi sa DNA
2\5: Direktang paagi sa PCR
3\6: Blangko nga kontrol
Pagkontrol sa kalidad:
Ang mga resulta sa pagsulay sa lain-laing mga kontrol nga gibutang sa eksperimento kinahanglan nga makatagbo sa mosunod nga mga kondisyon.Kay kon dili, ang hinungdan sa problema kinahanglang analisahon, ug ang pagsulay kinahanglang himoon pag-usab human mawagtang ang problema.
Talaan 1. Normal nga resulta sa pagsulay sa lain-laing mga kontrol nga grupo
* Kung ang plasmid gigamit ingon usa ka positibo nga kontrol, ang resulta sa endogenous gene test mahimong negatibo
Paghukom sa resulta:
A. Ang resulta sa pagsulay sa endogenous gene sa sample negatibo, nga nagpakita nga ang DNA nga angay alang sa ordinaryo nga PCR detection dili makuha gikan sa sample o ang gikuha nga DNA adunay PCR reaction inhibitors, ug ang DNA kinahanglan nga makuha pag-usab.
B. Ang resulta sa pagsulay sa endogenous gene sa sample mao ang positibo, ug ang resulta sa pagsulay sa exogenous gene negatibo, nga nagpakita nga ang DNA nga angay alang sa ordinaryo nga PCR detection gikuha gikan sa sample, ug kini mahimong pagahukman nga ang XXX gene dili mamatikdan sa sample.
C. Ang resulta sa pagsulay sa endogenous gene sa sample positibo, ug ang resulta sa pagsulay sa exogenous gene positibo, nga nagpakita nga ang DNA nga angay alang sa ordinaryo nga PCR detection gikuha gikan sa sample, ug ang sample DNA naglangkob sa XXX gene.Ang mga eksperimento sa pagkumpirma mahimo pa nga himuon.
Lakang 8: Mga primera sa pag-detect sa disenyo
Human sa eksperimento, gamita ang 2% nga sodium hypochlorite solution ug 70% nga ethanol solution aron pagpahid sa experimental area aron malikayan ang polusyon sa kinaiyahan.
Apendise
Talaan 2. Kasagarang gigamit nga primer para sa kinatibuk-ang PCR detection sa genetically modified nga mga tanom
Reperensya nga dokumento:
SN/T 1202-2010, Qualitative PCR detection method para sa genetically modified plant ingredients sa pagkaon.
Ministeryo sa Agrikultura Announcement 1485-5-2010, Pagsulay sa mga sangkap sa genetically modified nga mga tanom ug sa ilang mga produkto-bugas M12 ug sa iyang mga derivatives.
Oras sa pag-post: Hunyo-09-2021
