Pagsugod nga materyal: RNA
Ang quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) usa ka eksperimento nga pamaagi nga gigamit sa mga eksperimento sa PCR gamit ang RNA isip sinugdanan nga materyal.Niini nga pamaagi, ang kinatibuk-ang RNA o messenger RNA (mRNA) unang gi-transcribe ngadto sa complementary DNA (cDNA) pinaagi sa reverse transcriptase.Pagkahuman, usa ka reaksyon sa qPCR ang gihimo gamit ang cDNA ingon usa ka template.Ang RT-qPCR gigamit sa lainlaing mga aplikasyon sa biology sa molekula, lakip ang pag-analisa sa ekspresyon sa gene, pag-validate sa interference sa RNA, pag-validate sa microarray, pagtuki sa pathogen, pagsulay sa genetic, ug panukiduki sa sakit.
Usa ka lakang ug duha ka lakang nga pamaagi alang sa RT-qPCR
Ang RT-qPCR mahimong matuman pinaagi sa usa ka lakang o duha ka lakang nga pamaagi.Ang usa ka lakang nga RT-qPCR naghiusa sa reverse transcription ug PCR amplification, nga gitugotan ang reverse transcriptase ug DNA polymerase nga makompleto ang reaksyon sa parehas nga tubo sa ilawom sa parehas nga kondisyon sa buffer.Ang usa ka lakang nga RT-qPCR nagkinahanglan lamang sa paggamit sa sequence-specific primers.Sa duha ka lakang nga RT-qPCR, ang reverse transcription ug PCR amplification gihimo sa duha ka tubo, gamit ang lain-laing na-optimize nga buffer, mga kondisyon sa reaksyon, ug mga estratehiya sa disenyo sa primer.
| Bentaha | Disbentaha | |
| Usa ka Lakang | Kini nga pamaagi adunay gamay nga eksperimento nga sayup tungod kay ang duha nga mga reaksyon gihimo sa usa ka tubo
Diyutay nga mga lakang sa pipetting makapamenos sa risgo sa kontaminasyon
Angayan alang sa high-throughput amplification/screening, paspas ug reproducible | Ang duha ka lakang nga mga reaksyon dili ma-optimize nga gilain
Tungod kay ang mga kondisyon sa reaksyon nakompromiso pinaagi sa paghiusa sa duha ka lakang nga reaksyon, ang pagkasensitibo dili sama ka maayo sa duha ka lakang nga pamaagi.
Gamay ra ang gidaghanon sa mga target nga nakit-an sa usa ka sample |
| Duha ka Lakang | Abilidad sa paghimo sa stable nga mga librarya sa cDNA nga mahimong tipigan sa taas nga panahon ug magamit sa daghang mga reaksyon
Ang mga target nga gene ug reference genes mahimong mapadako gikan sa parehas nga librarya sa cDNA nga wala kinahanglana ang daghang mga librarya sa cDNA
Ang mga buffer sa reaksyon ug mga kondisyon sa reaksyon nga makahimo sa pag-optimize sa usa ka reaksyon nga dagan
Flexible nga pagpili sa mga kondisyon sa pag-trigger | Ang paggamit sa daghang mga tubo, ug daghang mga lakang sa pipetting nagdugang sa risgo sa kontaminasyon sa DNA, ug usik sa panahon.
Nagkinahanglan og dugang nga pag-optimize kaysa sa usa ka lakang nga pamaagi |
May kalabotan nga mga produkto:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Usa ka Lakang)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Usa ka Lakang)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Para sa First-Strand CDNA Synthesis
Tinuod nga Oras nga PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Tinuod nga Oras nga PCR Easyᵀᴹ-Taqman
Pagpili sa kinatibuk-ang RNA ug mRNA
Sa pagdesinyo ug RT-qPCR nga eksperimento, importante ang pagdesisyon kung gamiton ba ang kinatibuk-ang RNA o giputli nga mRNA isip template para sa reverse transcription.Bisan tuod ang mRNA mahimong makahatag og gamay nga mas taas nga pagkasensitibo, ang kinatibuk-ang RNA kanunay nga gigamit.Ang hinungdan niini mao nga ang kinatibuk-ang RNA adunay mas hinungdanon nga bentaha ingon usa ka materyal nga pagsugod kaysa mRNA.Una, ang proseso nanginahanglan gamay nga mga lakang sa pagputli, nga nagsiguro nga mas maayo nga quantitative recovery sa template ug mas maayo nga normalisasyon sa mga resulta sa pagsugod sa mga numero sa cell.Ikaduha, gilikayan niini ang lakang sa pagpauswag sa mRNA, nga makalikay sa posibilidad sa mga skewed nga resulta tungod sa lainlaing mga pagbawi sa lainlaing mga mRNA.Sa kinatibuk-an, tungod kay sa kadaghanan sa mga aplikasyon ang relatibong quantification sa target nga gene mas importante kaysa sa hingpit nga pagkasensitibo sa detection, ang kinatibuk-ang RNA mas angay sa kadaghanan sa mga kaso.
Reverse transcription primer
Sa duha ka lakang nga pamaagi, tulo ka lain-laing mga pamaagi ang magamit sa pag-una sa cDNA nga reaksyon: oligo(dT) primers, random primers, o sequence-specific primers.Kasagaran, ang oligo(dT) nga mga primer ug ang random nga mga primer gigamit sa kombinasyon.Kini nga mga primer nag-anne sa template nga mRNA strand ug naghatag og reverse transcriptase nga adunay sinugdanan nga punto alang sa synthesis.
| Pagpili sa primer | Istruktura ug gimbuhaton | Bentaha | Disbentaha |
| Oligo(dT) primer (o anchored oligo(dT) primer) | Gilugwayan nga pag-annea sa mga residu sa thymine sa poly(A) nga ikog sa mRNA;Ang anchor oligo(dT) nga primer adunay G, C, o A sa 3′ end (anchor site) | Synthesis sa full-length nga cDNA gikan sa poly(A)-tailed mRNA
Magamit kung gamay ra nga materyal sa pagsugod ang magamit
Ang anchoring site nagsiguro nga ang oligo(dT) primer nagbugkos sa 5′ poly(A) nga ikog sa mRNA | Angayan lamang alang sa pagpadako sa mga gene nga adunay poly(A) nga mga ikog
Pagkuha og cDNA nga giputol gikan sa priming site*2 sa poly(A)
Gipihig sa pagbugkos ngadto sa 3′ katapusan*
*Kini nga posibilidad maminusan kung ang anchored oligo(dT) primers gigamit |
| random nga primer
| 6 hangtod 9 nga mga base ang gitas-on, nga mahimong mag-anneal sa daghang mga site sa panahon sa RNA transcription | Anneal sa tanang RNAs (tRNA, rRNA, ug mRNA)
Angayan alang sa mga transcript nga adunay hinungdanon nga sekondaryang istruktura, o kung adunay gamay nga materyal sa pagsugod
Taas nga cDNA Yield | Ang cDNA gibalikbalik nga gi-transcribe gikan sa tanan nga RNA, nga kasagaran dili gusto ug mahimong matunaw ang signal sa target nga mRNA
maputol ang cDNA |
| sequence-specific nga mga primer | Pasadya nga mga primer nga nagpunting sa piho nga mga han-ay sa mRNA | espesipikong cDNA library
Pagpauswag sa pagkasensitibo
Paggamit sa reverse qPCR primers | Limitado lamang sa synthesis sa usa ka target nga gene |
Reverse transcriptase
Ang reverse transcriptase usa ka enzyme nga naggamit sa RNA sa pag-synthesize sa DNA.Ang ubang mga reverse transcriptases adunay RNase nga kalihokan ug makapaubos sa RNA strands sa RNA-DNA hybrid strands human sa transcription.Kung kini walay RNase enzymatic nga kalihokan, ang RNaseH mahimong idugang alang sa mas taas nga qPCR efficiency.Ang kasagarang gigamit nga mga enzyme naglakip sa Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase ug avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Alang sa RT-qPCR, kini mao ang sulundon nga sa pagpili sa usa ka reverse transcriptase uban sa mas taas nga thermostability, aron ang cDNA synthesis mahimo sa mas taas nga temperatura, pagsiguro sa malampuson nga transcription sa RNAs uban sa mas taas nga secondary istruktura, samtang nagpadayon sa ilang bug-os nga kalihokan sa tibuok reaksyon, nga moresulta sa mas taas nga cDNA abot.
May kalabotan nga mga produkto:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
RNase H nga kalihokan sa reverse transcriptase
Ang RNaseH makahimo sa pagpaubos sa RNA strands gikan sa RNA-DNA duplexes, nga nagtugot sa episyente nga synthesis sa double-stranded DNA.Bisan pa, kung mogamit ug taas nga mRNA ingon usa ka template, ang RNA mahimong madaot sa wala pa panahon, nga moresulta sa naputol nga cDNA.Busa, kanunay nga mapuslanon ang pagpamenos sa kalihokan sa RNaseH sa panahon sa pag-clone sa cDNA kung gusto ang synthesis sa taas nga mga transcript.Sa kasukwahi, ang mga reverse transcriptases nga adunay kalihokan sa RNase H kanunay nga mapuslanon alang sa mga aplikasyon sa qPCR tungod kay gipauswag nila ang pagtunaw sa mga duplex sa RNA-DNA sa una nga siklo sa PCR.
Panguna nga disenyo
Ang mga primer sa PCR nga gigamit alang sa lakang sa qPCR sa RT-qPCR kinahanglan nga labing maayo nga gidisenyo aron mosangkad sa usa ka exon-exon junction, diin ang usa ka amplification primer mahimo’g mosangkap sa usa ka aktwal nga utlanan sa exon-intron.Tungod kay ang intron-containing genomic DNA sequences wala gipadako, kini nga disenyo nagpamenos sa risgo sa mga sayop nga positibo nga gipadako gikan sa pagkontaminar sa genomic DNA.
Kung ang mga primer dili mahimo nga gidisenyo aron mabulag ang mga utlanan sa exon o exon-exon, mahimo’g kinahanglan nga pagtratar ang mga sample sa RNA nga adunay RNase-free DNase I o dsDNase aron makuha ang kontaminasyon sa genomic DNA.
Pagkontrol sa RT-qPCR
Ang reverse transcription nga negatibong kontrol (-RT control) kinahanglang iapil sa tanang RT-qPCR nga mga eksperimento aron makamatikod sa kontaminasyon sa DNA (sama sa genomic DNA o PCR nga mga produkto gikan sa nangaging mga reaksyon).Kini nga kontrol naglangkob sa tanan nga mga sangkap sa reaksyon gawas sa reverse transcriptase.Tungod kay ang reverse transcription wala mahitabo uban niini nga kontrol, kung ang PCR amplification maobserbahan, ang kontaminasyon gikan sa DNA lagmit.
Oras sa pag-post: Ago-02-2022
