Ang kolum gisaksak

Human ma-plug ang column, ang RNA yield mikunhod o bisan imposible nga maputli ang RNA, ug ang nakuha nga RNA mass ubos.

Kasagaran nga pagtuki sa hinungdan:

1. Ang mga sample break dili hingpit.

Ang sample breakage dili hingpit nga hinungdan sa DNA-CLEANING COLUMN nga mabara, samtang makaapekto sa RNA yield ug kalidad.Girekomenda namon ang paspas nga paggaling nga operasyon sa usa ka igo nga likido nga nitroheno kung imong gibuak ang mga sample, Sulayi nga dugmokon ang sample cell wall, cell lamad ug uban pang tisyu.Para sa mga sample sa tanom sa polyol polysaccharides, among girekomendar nga imong gamiton ang Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. Kung gisuyop ang gibulag nga sample supernatant nga adunay DNA-Cleaning Column, ang posible nga cell fragmented precipitate mahimong mahawa.

Ang cell fragmented sediments nga gikuha maoy hinungdan sa RNA-ONLY Column nga mabara kung ang RNA adsorption operation gihimo (tan-awa ang lakang 6).Girekomenda namon nga mabinantayon ka kung gisuyop kini nga supernatant aron malikayan ang mga tinumpag sa cell nga masuyop.

3. Ang sample nga inisyal nga kantidad sobra ra kaayo.

Ang sobra nga paggamit sa sample moresulta sa dili kompleto nga sample fragmentation o dili kompleto nga cell lysis pinaagi sa Buffer PSL1, nga moresulta sa pagbabag sa kolum sa pagputli sa panahon sa pagputli.Tanan Kinatibuk-ang RNA Isolation Kit Ang matag usa ka purified operating sample kay 50 mg.Para sa mga sample sa tanom sa polyol polysaccharides, among girekomendar nga imong sulayan ang Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. Ang temperatura sa centrifuge ubos kaayo.

Ang tibuuk nga proseso sa pag-inusara ug pagputli sa RNA gihimo sa temperatura sa kwarto (20-25°C), gawas nga ang sample tissue nabuak sa liquid nitrogen.Ang temperatura sa pipila cryogenic centrifuges mao ang ubos pa kay sa 20℃, nga mahimong hinungdan sa pagbabag sa DNA-Cleaning Column ug/o RNA-Only Column.Kung mahitabo kini, ibutang ang temperatura sa centrifuge sa 20-25℃, ugsiguroa nga ang lysis mixture ug/o ang ethanol-added supernatant gipainit sa 37°C.

Walay RNA nga gikuha o RNA nga ani nga ubos

Kasagaran adunay daghang mga hinungdan nga makaapekto sa pagkaayo sa pagkaayo, sama sa: sample nga sulud sa RNA, pamaagi sa operasyon, gidaghanon sa elution, ug uban pa.

Pag-analisar sa kasagarang mga hinungdan sama sa ubos:

1.Usa ka ice bath o ubos nga temperatura (4°C) centrifugation gihimo sa panahon sa operasyon.

Sugyot: Pag-opera sa temperatura sa lawak (15-25°C) sa tibuok proseso, ayaw pagbuhat sa ice bath ug ubos nga temperatura centrifugation.

2. Ang RNA nadaot tungod sa dili husto nga pagpreserbar sa sample o dugay nga pagpreserbar sa sample.

Rekomendasyon: Ang mga bag-ong nakolekta nga mga sampol kinahanglan nga dali nga ma-frozen sa likido nga nitroheno, ug dayon tipigan sa -80 ° C sa dugay nga panahon, likayan ang balik-balik nga pagyelo ug pagtunaw sa mga sampol;o ihumol dayon ang mga sample sa RNA stabilizer nga RNAlater solution (mga sample sa hayop).

3.Ang dili igo nga sample fragmentation ug lysis mosangpot sa pagbabag sa kolum sa pagputli.

Sugyot: Sa paggaling sa tisyu, palihog siguroha nga ang tisyu igo nga gigaling, ug ibalhin dayon kini ngadto sa giandam nang daan nga Buffer PSL1 (kumpirmahi nga ang husto nga proporsyon sa β-ME gidugang, tan-awa ang lakang 1 sa pamaagi).

4. Ang eluent gidugang nga sayop.

Sugyot: Siguroha nga ang RNase-Free ddH2O natulo sa tunga sa purification column membrane.

5. Ang husto nga gidaghanon sa hingpit nga ethanol wala gidugang sa Buffer PSL2 o Buffer PRW2.

Sugyot: Palihug sunda ang mga instruksyon, idugang ang saktong gidaghanon sa absolute ethanol sa Buffer PSL2 ug Buffer PRW2 ug sagola og maayo sa dili pa gamiton ang kit.

6. Ang gidaghanon sa sample sa tissue dili angay.

Sugyot: Paggamit og 50 mg nga tissue kada 500 μl sa Buffer PSL1.Ang paggamit sa sobra nga tisyu makapakunhod sa gidaghanon sa RNA nga makuha ug ang kaputli sa resulta nga RNA makunhuran usab.Kami kusganong girekomenda nga ang inisyal nga sample nga dosis kinahanglan dili molapas sa 50 mg matag operasyon sa pagkuha sa RNA.

7. Dili angay nga elution volume o dili kompleto nga elution.

Sugyot: Ang eluent volume sa purification column mao ang 50-200 μl;kung ang epekto sa elution dili makatagbaw, girekomenda nga i-extend ang oras sa temperatura sa kwarto pagkahuman idugang ang preheated RNase-Free ddH2O, sama sa 5-10min.

8.Ang purification column adunay ethanol residue human sa paghugas sa BufferPRW2.

Sugyot: Kung ang walay sulod nga tubo gi-centrifuged sulod sa 1 min ug adunay nahabilin nga ethanol human sa paghugas sa Buffer PRW2, mahimo nimong dugangan ang oras sa centrifugation sa walay sulod nga tube ngadto sa 2 min, o ibutang ang purification column sa temperatura sa lawak sulod sa 5 min aron hingpit nga makuha ang nahabilin nga ethanol.

9. Ang kit gigamit sa sayop nga paagi.

Sugyot: Para sa mga sampol sa tanom nga polyphenolic polysaccharides, gamit ang komon nga mga kit sama sa Plant Total RNA Isolation Kit mahimong dili makakuha ug ideal nga RNA samples.Girekomenda ka namon nga gamiton ang Tanum Total RNA IsolationKit Plus, nga espesyal nga gidisenyo alang sa polyphenolic polysaccharide sample sa tanum.Usa ka kit nga espesyal nga gihimo alang sa pagkuha sa RNA gikan sa polyphenol ug polysaccharide nga mga sample sa tanum.

Ubos ang kantidad sa OD260/OD280

Ang elution sa RNA nga adunay ddH2O ug gigamit alang sa mga pagbasa sa spectrophotometer nagresulta sa ubos nga mga kantidad sa OD260/OD280.Among girekomendar ang paggamit sa 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 (imbes nga RNase-Free ddH2O aron ma-elute ang RNA) aron makuha ang medyo husto nga OD260/OD280 values, tan-awa ang “RNA Concentration and Purification Assays” sa pahina 19.

Ang giputli nga RNA nadaot

Ang kalidad sa giputli nga RNA adunay kalabotan sa mga hinungdan sama sa pagpreserbar sa sample, kontaminasyon sa RNase, ug pagmaniobra.

Pag-analisar sa kasagarang mga hinungdan:

1. Ang mga sampol sa tisyu wala gitipigan sa oras pagkahuman sa pagkolekta.

Rekomendasyon: Kung ang mga sampol sa tisyu wala magamit sa oras pagkahuman sa pagkolekta, palihug ibutang kini sa likido nga nitroheno sa ubos nga temperatura dayon o ibalhin kini sa -80 ° C alang sa dugay nga pagtipig pagkahuman sa dali nga pagyelo sa likido nga nitroheno, o dayon ituslob ang mga sample sa RNA stabilizer nga solusyon sa RNAlater (mga sample sa hayop).Alang sa pagkuha sa RNA, sulayi ang paggamit sa bag-ong nakolekta nga mga sample sa tisyu.

2. Gibalikbalik nga pagyelo ug pagtunaw sa mga sample sa tisyu.

Sugyot: Kung magtipig ug mga sample sa tisyu, labing maayo nga putlon kini ngadto sa gagmay nga mga piraso aron mapreserbar, ug kuhaon ang usa ka bahin niini kung gamiton kini aron malikayan ang pagkadaot sa RNA tungod sa balik-balik nga pagyelo ug pagtunaw sa mga sample.

3. Ang RNase gipaila sa operating room o wala gisul-ob nga disposable gloves, maskara, ug uban pa.

Sugyot: Ang mga eksperimento sa pagkuha sa RNA labing maayo nga gihimo sa bulag nga mga operasyon sa RNA, ug ang lamesa sa laboratoryo kinahanglan nga limpyohan sa wala pa ang eksperimento, ug ang mga disposable nga gwantis ug mga maskara kinahanglan isul-ob sa panahon sa eksperimento aron malikayan ang pagkadaot sa RNA tungod sa pagpaila sa RNase sa labing kadaghan.

4.Ang reagent kontaminado sa RNase sa panahon sa paggamit.

Sugyot: Pag-ilis og bag-ong serye sa kinatibuk-ang RNA extraction kits sa tanom para sa may kalabotan nga mga eksperimento.

5. Ang centrifuge tubes ug pipette tips nga gigamit alang sa RNA manipulation kontaminado sa RNase.

Sugyot: Siguroa nga ang centrifuge tubes, pipette tips, pipettes, ug uban pa nga gigamit sa RNA extraction kay RNase-Free.

Mga Manwal sa Instruksyon:

Tanum Total RNA Isolation Kit Plus Instruction Manual