• Ang PCR usa ka pamaagi nga gigamit sa pagpadako sa DNA gikan sa gamay nga kantidad sa template sa DNA.Ang RT-PCR naggamit ug reverse transcription aron makagama ug DNA template gikan sa RNA source nga mahimo unyang mapadako.
• Ang PCR ug RT-PCR kasagarang endpoint reactions, samtang ang qPCR ug RT-qPCR naggamit sa kinetics sa rate sa product synthesis atol sa PCR reaction aron ma-quantitate ang gidaghanon sa template nga anaa.
• Ang mas bag-ong mga pamaagi, sama sa digital PCR, naghatag ug hingpit nga quantitation sa inisyal nga DNA template, samtang ang mga pamaagi sama sa isothermal PCR makapamenos sa panginahanglan sa mahal nga ekipo aron makahatag ug kasaligang resulta.

Ang polymerase chain reaction (PCR) usa ka medyo simple ug kaylap nga gigamit nga molecular biology nga teknik aron mapadako ug makit-an ang mga han-ay sa DNA ug RNA.Kon itandi sa tradisyonal nga mga paagi sa DNA cloning ug amplification, nga kasagarang mokabat ug mga adlaw, ang PCR nagkinahanglan lamang ug pipila ka oras.Ang PCR sensitibo kaayo ug nanginahanglan gamay nga template alang sa pag-ila ug pagpadako sa piho nga mga han-ay.Ang sukaranan nga mga pamaagi sa PCR labi nga nag-uswag gikan sa yano nga pagtuki sa DNA ug RNA.Sa ubos, naghatag kami usa ka kinatibuk-ang panan-aw sa lainlaing mga pamaagi sa PCR ug ang mga reagents nga among gihatag sa Enzo Life Sciences alang sa imong mga panginahanglanon sa panukiduki.Tumong namo nga tabangan ang mga siyentista nga dali nga maka-access sa mga PCR reagents aron magamit sa ilang sunod nga proyekto sa panukiduki!

PCR

Para sa standard nga PCR, ang imong gikinahanglan mao ang DNA polymerase, magnesium, nucleotides, primers, ang DNA template nga i-amplified, ug usa ka thermocycler.Ang mekanismo sa PCR kay yano ra sa katuyoan niini: 1) double-stranded DNA (dsDNA) kay heat denatured, 2) primers align sa single DNA strands, ug 3) ang primers gipalugwayan sa DNA polymerase, nga miresulta sa duha ka kopya sa orihinal nga DNA strand.Ang denaturation, annealing, ug elongation nga proseso sa usa ka serye sa mga temperatura ug mga panahon nailhan nga usa ka cycle sa amplification (Fig. 1).

Ang matag lakang sa siklo kinahanglan nga ma-optimize alang sa template ug primer set nga gigamit.Kini nga siklo gisubli sa gibana-bana nga 20-40 ka beses, ug ang gipadako nga produkto mahimo unya nga analisahon, kasagaran pinaagi sa agarose gel (Fig. 2).

Tungod kay ang PCR usa ka sensitibo kaayo nga pamaagi ug gamay kaayo nga volume ang gikinahanglan alang sa usa ka reaksyon, girekomenda ang pag-andam sa usa ka master mix alang sa daghang mga reaksyon.Ang master mix kinahanglan nga maayo nga sagol ug dayon bahinon sa gidaghanon sa mga reaksyon, pagsiguro nga ang matag reaksyon adunay parehas nga kantidad sa enzyme, dNTPs, ug mga primer.Daghang mga suppliers, sama sa Enzo Life Sciences, nagtanyag usab sa PCR mixes nga naa na sa tanan gawas sa mga primer ug DNA template.

Guanine/Cytosine-rich (GC-rich) nga mga rehiyon nagrepresentar sa usa ka hagit sa standard nga mga teknik sa PCR.Ang mga han-ay nga puno sa GC mas lig-on kaysa mga han-ay nga adunay ubos nga sulud sa GC.Dugang pa, ang mga han-ay nga dato sa GC lagmit nga mahimong mga sekondaryang istruktura, sama sa hairpin loops.Ingon nga resulta, ang GC-rich double strands lisud nga hingpit nga mabulag sa panahon sa denaturation phase.Tungod niini, ang DNA polymerase dili maka-synthesize sa bag-ong strand nga walay babag.Ang mas taas nga temperatura sa denaturation makapauswag niini, ug ang mga pag-adjust ngadto sa mas taas nga temperatura sa annealing ug mas mubo nga oras sa pag-annealing makapugong sa dili piho nga pagbugkos sa mga primerong puno sa GC.Ang dugang nga mga reagents makapauswag sa pagpadako sa mga han-ay nga puno sa GC.Ang DMSO, glycerol, ug betaine makatabang sa pagsamok sa mga sekondaryang istruktura nga gipahinabo sa mga interaksyon sa GC ug sa ingon mapadali ang pagbulag sa doble nga mga hilo.

Mainit nga Pagsugod sa PCR

Ang dili piho nga pagpadako usa ka problema nga mahimong mahitabo sa panahon sa PCR.Kadaghanan sa mga polymerase sa DNA nga gigamit alang sa PCR labing maayo nga molihok sa temperatura nga mga 68 ° C hangtod 72 ° C.Ang enzyme mahimo usab nga aktibo sa mas ubos nga temperatura, bisan sa mas ubos nga lebel.Sa mga temperatura nga ubos kaayo sa temperatura sa annealing, ang mga primer mahimong mobugkos nga dili espesipiko ug mosangpot sa dili piho nga pagpadako, bisan kung ang reaksyon gibutang sa yelo.Mahimo kining mapugngan pinaagi sa paggamit sa polymerase inhibitors nga mobulag gikan sa DNA polymerase sa higayon nga maabot ang usa ka piho nga temperatura, busa ang termino nga init nga pagsugod sa PCR.Ang tigpugong mahimong usa ka antibody nga nagbugkos sa polymerase ug nag-denatur sa inisyal nga temperatura sa denaturation (kasagaran 95°C).

Taas nga Fidelity Polymerase

Samtang ang mga polymerase sa DNA igo nga nagpadako sa orihinal nga han-ay sa template, ang mga sayup sa pagpares sa nucleotide mahimong mahitabo.Ang dili pagkapareha sa mga aplikasyon sama sa pag-clone mahimong moresulta sa naputol nga mga transcript, ug sayop nga pagkahubad o dili aktibo nga mga protina sa ubos.Aron malikayan kini nga mga mismatch, ang mga polymerase nga adunay "proofreading" nga kalihokan giila ug gilakip sa workflow.Ang unang proofreading polymerase, Pfu, giila niadtong 1991 sa Pyrococcus furiosus.Kini nga Pfu enzyme adunay 3' ngadto sa 5' exonuclease nga kalihokan.Samtang gipadako ang DNA, gitangtang sa exonuclease ang dili parehas nga mga nucleotide sa 3' tumoy sa strand.Ang husto nga nucleotide ilisan dayon, ug ang DNA synthesis nagpadayon.Ang pag-ila sa dili husto nga mga han-ay sa nucleotide gibase sa pagbugkos nga affinity alang sa husto nga nucleoside triphosphate uban sa enzyme, diin ang dili maayo nga pagbugkos nagpahinay sa synthesis ug nagtugot sa husto nga pagpuli.Ang kalihokan sa pag-proofread sa Pfu polymerase nagresulta sa gamay nga mga sayup sa katapusan nga pagkasunod-sunod kung itandi sa Taq DNA polymerase.Sa bag-ohay nga mga tuig, ang ubang mga proofreading enzymes naila, ug ang mga pagbag-o sa orihinal nga Pfu enzyme gihimo aron sa dugang pa nga pagkunhod sa error rate sa panahon sa DNA amplification.

RT-PCR

Ang reverse transcription PCR, o RT-PCR, nagtugot sa paggamit sa RNA isip template.Ang usa ka dugang nga lakang nagtugot sa pagkakita ug pagpadako sa RNA.Ang RNA gi-reverse transcribe ngadto sa complementary DNA (cDNA), gamit ang reverse transcriptase.Ang kalidad ug kaputli sa template sa RNA hinungdanon alang sa kalampusan sa RT-PCR.Ang unang lakang sa RT-PCR mao ang synthesis sa DNA/RNA hybrid.Ang reverse transcriptase usab adunay usa ka RNase H function, nga nagdaot sa RNA nga bahin sa hybrid.Ang single-stranded nga molekula sa DNA makompleto sa DNA-dependent nga DNA polymerase nga kalihokan sa reverse transcriptase ngadto sa cDNA.Ang kaepektibo sa reaksyon sa una nga strand mahimong makaapekto sa proseso sa pagpadako.Gikan dinhi, ang standard nga pamaagi sa PCR gigamit aron mapadako ang cDNA.Ang posibilidad nga ibalik ang RNA ngadto sa cDNA pinaagi sa RT-PCR adunay daghang mga bentaha, ug kini panguna nga gigamit alang sa pagtuki sa ekspresyon sa gene.Ang RNA usa ka stranded ug dili kaayo lig-on, nga naghimo niini nga mahagiton sa pagtrabaho.Kasagaran kini nagsilbi nga una nga lakang sa qPCR, nga nag-ihap sa mga transcript sa RNA sa usa ka biological nga sample.

qPCR ug RT-qPCR

Ang quantitative PCR (qPCR) gigamit sa pag-ila, pag-ila ug pag-ihap sa mga nucleic acid alang sa daghang mga aplikasyon.Sa RT-qPCR, ang mga transcript sa RNA kanunay nga gi-quantified pinaagi sa pag-reverse nga pag-transcribe niini sa cDNA una, sama sa gihulagway sa ibabaw, ug pagkahuman gipatuman ang qPCR.Sama sa naandan nga PCR, ang DNA gipadako sa tulo nga nagbalikbalik nga mga lakang: denaturation, annealing, ug elongation.Bisan pa, sa qPCR, ang pag-label sa fluorescent makahimo sa pagkolekta sa datos samtang nag-uswag ang PCR.Kini nga teknik adunay daghang mga benepisyo tungod sa lainlaing mga pamaagi ug mga kemikal nga magamit.

Sa qPCR nga nakabase sa tina (kasagarang berde), ang pag-label sa fluorescent nagtugot sa pag-ihap sa gipadako nga mga molekula sa DNA pinaagi sa paggamit sa usa ka dsDNA binding dye.Sa matag siklo, ang fluorescence gisukod.Ang fluorescence signal nagdugang proporsyonal sa gidaghanon sa gisubli nga DNA.Busa, ang DNA gi-quantified sa "real-time" (Fig. 3).Ang mga disbentaha sa qPCR nga nakabase sa tina mao nga usa ra ka target ang masusi sa usa ka higayon ug nga ang tina mogapos sa bisan unsang ds-DNA nga naa sa sample.

Sa qPCR nga nakabase sa probe, daghang mga target ang mahimong mamatikdan nga dungan sa matag sample, apan kini nanginahanglan pag-optimize ug disenyo sa usa ka (mga) target nga piho nga probe nga gigamit dugang sa mga primer.Daghang mga matang sa mga disenyo sa probe ang anaa, apan ang labing komon nga tipo mao ang hydrolysis probe, nga naglakip sa fluorophore ug quencher.Ang fluorescence resonance energy transfer (FRET) nagpugong sa pagpagawas sa fluorophore pinaagi sa quencher samtang ang probe wala pa.Bisan pa, sa panahon sa reaksyon sa PCR, ang probe na-hydrolyzed sa panahon sa pagpalapad sa primer ug pagpadako sa piho nga pagkasunod-sunod nga gigapos niini.Ang cleavage sa probe nagbulag sa fluorophore gikan sa quencher ug miresulta sa usa ka amplification-dependent nga pagtaas sa fluorescence (Fig. 4).Busa, ang fluorescence signal gikan sa probe-based qPCR reaction kay proporsyonal sa gidaghanon sa probe target sequence nga anaa sa sample.Tungod kay ang probe-based qPCR mas espesipiko kay sa dye-based qPCR, kasagaran kini ang teknolohiya nga gigamit sa qPCR-based diagnostic assays.

Isothermal Amplification

Ang PCR nga gihisgotan sa ibabaw nga mga teknik nanginahanglan ug mahal nga thermocycling nga kagamitan aron saktong mosaka ug mopaubos sa temperatura sa chamber para sa denaturation, annealing, ug extension nga mga lakang.Daghang mga teknik ang naugmad nga wala magkinahanglan sa ingon nga tukma nga mga aparato ug mahimo nga himuon sa usa ka yano nga kaligoanan sa tubig o bisan sa sulod sa mga selyula nga interesado.Kini nga mga teknik gitawag nga isothermal amplification ug trabaho base sa exponential, linear, o cascade amplification.

Ang labing nailhan nga matang sa isothermal amplification mao ang loop-mediated isothermal amplification, o LAMP.Ang LAMP naggamit sa exponential amplification sa 65⁰C aron mapadako ang template nga DNA o RNA.Sa pagbuhat sa LAMP, upat ngadto sa unom ka primer nga komplementaryo sa mga rehiyon sa target nga DNA ang gigamit sa usa ka DNA polymerase sa pag-synthesize sa bag-ong DNA.Ang duha niini nga mga primer adunay mga complimentary sequence nga nag-ila sa mga sequence sa ubang mga primers ug nagbugkos niini, nga nagtugot sa usa ka "loop" nga estraktura nga maporma sa bag-ong synthesized DNA nga makatabang sa primer annealing sa sunod nga mga hugna sa amplification.Ang LAMP mahimong makita pinaagi sa daghang mga pamaagi, lakip ang fluorescence, agarose gel electrophoresis, o colorimetry.Ang kadali sa paghanduraw ug pag-ila sa presensya o pagkawala sa produkto pinaagi sa colorimetry ug ang kakulang sa mahal nga kagamitan nga gikinahanglan naghimo sa LAMP nga usa ka angay nga kapilian alang sa pagsulay sa SARS-CoV-2 sa mga lugar diin ang pagsulay sa klinikal nga lab dili dali magamit, o pagtipig ug pagdala sa mga sample dili mahimo, o sa mga lab nga wala kaniadto PCR thermocycling equipment.