Ang pagmatuod sa pagbuhat sa mga primer ug probe sa unang yugto sa PCR reagents ug pagtino sa labing angay nga kondisyon sa reaksyon mao ang gikinahanglan aron maseguro ang hapsay nga pag-uswag sa pormal nga mga eksperimento.
Busa unsaon nato pagkumpirma ang primer probe sa unang yugto?
Ang mga nag-unang indicators mao ang baseline, amplification curve, ct value, amplification efficiency, low-concentration sample detection, CV, etc.
Baseline
Ang baseline mao ang pinahigda nga linya sa PCR amplification curve.Sa unang pipila ka mga cycle sa PCR amplification reaction, ang fluorescence signal dili kaayo mausab ug nagporma og tul-id nga linya.Kining tul-id nga linya mao ang baseline.
Kung nag-screen sa PCR primer probes, hatagi'g pagtagad kung ang baseline ba lebel.Ang kaputli sa konsentrasyon sa primer probe makaapekto sa baseline, sama sa hinungdan sa pagsaka o pagkahulog sa baseline.Ang baseline usa usab ka intuitive nga timailhan.
Amplification Curve
Ang laing intuitive indicator mao ang porma sa amplification curve.Labing maayo nga adunay usa ka S-shaped nga kurba aron malikayan ang ikaduha nga pagpadako o uban pang dili normal nga mga kurba sa pagpadako.
Ct Bili
Ang gidaghanon sa mga cycle nga katumbas sa inflection point gikan sa baseline ngadto sa exponential growth mao ang Ct value.
Alang sa parehas nga sample, ang lainlaing mga pagsusi sa primer nagresulta sa lainlaing mga kurba sa amplification, ug ang katugbang nga kantidad sa Ct maapektuhan sa kahusayan sa amplification ug degree sa interference.Sa teoriya, ang mas gamay nga Ct nga kantidad sa primer probe nga atong gipili, mas maayo.
Episyente sa Pagpadako
Usa sa labing kasaligan ug lig-on nga mga pamaagi sa pagtimbang-timbang sa kahusayan sa pagpadako sa PCR mao ang sukaranan nga kurba, nga kaylap nga giila sa mga tigdukiduki.Ang pamaagi naglakip sa paghimo sa usa ka serye sa mga sample aron makontrol ang relatibong gidaghanon sa mga target templates.Kini nga mga sampol kasagaran gihimo pinaagi sa mga serial dilution sa concentrated stock solutions, ang kasagarang gigamit mao ang 10-fold dilution.Gamit ang usa ka serye sa mga lasaw nga sample, gamit ang standard nga qPCR nga programa aron mapadako aron makuha ang Cq value, ug sa katapusan magdrowing og standard curve sumala sa konsentrasyon sa matag sample ug ang katumbas nga Cq value aron makuha ang linear equation Cq= -klgX0+b, ug ang amplification efficiency E=10(-1 /k) -1.Kung gamiton ang qPCR para sa quantitative analysis, ang amplification efficiency gikinahanglan nga anaa sa range nga 90% -110% (3.6>k>3.1).
Ubos-konsentrasyon Sample Detection
Kung ubos ang konsentrasyon sa sample, lahi ang mga rate sa pagkakita sa lainlaing mga pagsusi sa primer.Gipili namo ang 20 ka ubos nga konsentrasyon nga mga sample aron makopya, ug ang primer-probe system nga adunay pinakataas nga detection rate mao ang pinakamaayo.
Coefficient of Variation (CV)
Ang 10 ka duplicate nga mga sample mahimong makit-an nga adunay lain-laing mga primer probes sumala sa linya nga sumbanan sa reagent alang sa nucleic acid amplification detection.
Gidaghanon nga Reagents:
Pagkatukma
Ang katukma sa sulod sa usa ka batch kinahanglan nga magtagbo: ang coefficient of variation (CV,%) sa logarithmic value sa konsentrasyon sa pagsulay mao ang ≤5%.Kung ubos ang sample nga konsentrasyon, ang coefficient of variation (CV,%) sa logarithm sa detection concentration mao ang ≤10%
Kwalitatibo nga mga reagents:
Pagkatukma
Ang katukma sa sulod sa usa ka batch kinahanglan nga makab-ot:
(1) Coefficient sa variation sa Ct value (CV,%) ≤5%
Ang parehas nga sample gisulayan nga managsama sa 10 ka beses, ug ang mga resulta sa pagsulay kinahanglan nga makanunayon
Oras sa pag-post: Sep-18-2021
