Ang Fluorescence quantitative PCR (nailhan usab nga TaqMan PCR, human niini gitawag nga FQ-PCR) maoy usa ka bag-ong nucleic acid quantitative nga teknolohiya nga gimugna sa PE (Perkin Elmer) sa United States niadtong 1995. Kini nga teknolohiya gibase sa naandan nga PCR pinaagi sa pagdugang ug fluorescent labeled probes.Kung itandi sa flexible PCR, ang FQ-PCR adunay daghang mga bentaha aron maamgohan ang quantitative function niini.Kini nga artikulo nagtinguha sa mubo nga paghulagway sa mga kinaiya, mga prinsipyo, mga pamaagi, ug mga aplikasyon sa teknolohiya.
1 Mga bahin
Ang FQ-PCR dili lamang adunay taas nga pagkasensitibo sa ordinaryo nga PCR, apan tungod usab sa paggamit sa fluorescent probes, kini direkta nga makamatikod sa pagbag-o sa fluorescent signal sa panahon sa PCR amplification pinaagi sa photoelectric conduction system aron makakuha og quantitative nga mga resulta, nga nakabuntog sa daghang mga kakulangan sa conventional PCR, mao nga kini usab adunay taas nga espesipiko sa DNA hybridization sa spectroscopy.
Pananglitan, ang kinatibuk-ang mga produkto sa PCR kinahanglan nga obserbahan pinaagi sa agarose gel electrophoresis ug ethidium bromide staining sa ultraviolet light o pinaagi sa polyacrylamide gel electrophoresis ug silver staining.Dili lamang kini nagkinahanglan og daghang mga instrumento, apan nagkinahanglan usab og panahon ug paningkamot.Ang mga mantsa nga gigamit nga Ethidium bromide makadaot sa lawas sa tawo, ug kini nga komplikado nga mga pamaagi sa eksperimento naghatag higayon sa polusyon ug mga sayup nga positibo.Bisan pa, ang FQ-PCR kinahanglan ra nga ablihan ang taklob kausa sa panahon sa pagkarga sa sample, ug ang sunod nga proseso hingpit nga closed-tube nga operasyon, nga wala magkinahanglan og post-processing sa PCR, paglikay sa daghang mga kakulian sa naandan nga operasyon sa PCR.Ang eksperimento kasagaran naggamit sa ABI7100 PCR thermal cycler nga gihimo sa PE nga kompanya.
Ang instrumento adunay mga mosunod nga mga kinaiya: ① Lapad nga aplikasyon: Kini magamit alang sa DNA ug RNA PCR nga pag-ihap sa produkto, panukiduki sa ekspresyon sa gene, pagtuki sa pathogen, ug pag-optimize sa mga kondisyon sa PCR.② Talagsaon nga quantitative nga prinsipyo: Gamit ang fluorescently labeled probes, ang gidaghanon sa fluorescence magtigum uban sa PCR cycle human sa laser excitation, aron makab-ot ang katuyoan sa quantification.③ Taas nga kahusayan sa pagtrabaho: Gitukod-sa 9600 PCR thermal cycler, kontrolado sa kompyuter 1 hangtod 2 ka oras aron makompleto ang pagpadako ug pag-ihap sa 96 nga mga sample awtomatiko ug dungan.④ Dili kinahanglan ang gel electrophoresis: Dili kinahanglan nga lasaw ug electrophoresis ang sample, gamita lang ang usa ka espesyal nga probe aron makit-an direkta sa tubo sa reaksyon.⑤Walay polusyon sa pipeline: Ang talagsaon nga bug-os nga gilakip nga reaksyon nga tubo ug photoelectric conduction system gisagop, mao nga dili kinahanglan nga mabalaka bahin sa polusyon.⑥Ang mga resulta mabag-o: ang quantitative dynamic range hangtod sa lima ka order sa magnitude.Busa, tungod kay kini nga teknolohiya malampuson nga naugmad, kini gipabilhan sa daghang siyentipikong tigdukiduki ug gipadapat sa daghang natad.
2 Mga prinsipyo ug pamaagi
Ang prinsipyo sa pagtrabaho sa FQ-PCR mao ang paggamit sa 5′→3′ exonuclease nga kalihokan sa Taq enzyme aron makadugang ug fluorescently labeled nga probe sa PCR reaction system.Ang probe mahimong espesipikong mag-hybrid sa DNA template nga anaa sa primer sequence.Ang 5′end sa probe gimarkahan sa fluorescence emission gene FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence emission peak sa 518nm), ug ang 3′end gimarkahan sa The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence emission peak sa 582 nga pagpuga sa 582 nga pagpuga sa peak sa 582 nga pagpugong sa fluorescence sa 582 ′ ang probe gikan sa pagpalugway sa panahon sa PCR amplification.Sa diha nga ang probe nagpabilin nga wala'y labot, ang quencher nga grupo nagpugong sa fluorescence emission sa emitting nga grupo.Sa higayon nga ang emitting nga grupo nahimulag gikan sa quenching nga grupo, ang pagdili gibayaw, ug ang optical densidad sa 518nm nagdugang ug namatikdan sa fluorescence detection system.Sa renaturation phase, ang probe hybridizes sa template DNA, ug ang Taq enzyme sa extension phase nagalihok ubay sa DNA template uban sa extension sa primer.Kung maputol ang probe, ang epekto sa pagpalong gibuhian ug ang signal sa fluorescent gipagawas.Sa matag higayon nga ang template gikopya, ang usa ka probe maputol, inubanan sa pagpagawas sa usa ka fluorescent signal.Tungod kay adunay usa-sa-usa nga relasyon tali sa gidaghanon sa gipagawas nga fluorophores ug sa gidaghanon sa mga produkto sa PCR, kini nga teknik mahimong gamiton sa tukma nga pag-ihap sa template.Ang instrumento sa eksperimento kasagaran naggamit sa ABI7100 PCR thermal cycler nga gimugna sa PE nga kompanya, ug ang ubang mga thermal cyclers mahimo usab nga gamiton.Kung ang sistema sa reaksyon nga tipo sa reaksyon nga ABI7700 gigamit alang sa eksperimento, pagkahuman nahuman ang reaksyon, ang mga resulta sa quantitative mahimong direkta nga gihatag pinaagi sa pagtuki sa kompyuter.Kung mogamit ka ug ubang mga thermal cyclers, kinahanglan nimo nga mogamit usa ka fluorescence detector aron sukdon ang signal sa fluorescence sa reaksyon nga tubo sa parehas nga oras aron makalkulo ang RQ +, RQ-, △RQ.Ang RQ + nagrepresentar sa ratio sa luminescence intensity sa fluorescent emission group sa sample tube ngadto sa luminescence intensity sa quenching group, RQ- nagrepresentar sa ratio sa duha sa blangko nga tubo, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) nagrepresentar sa gidaghanon sa fluorescence signal nga pagbag-o sa panahon sa PCR Human sa pagproseso sa datos mahimong quanti.Tungod sa pagpaila sa mga fluorescent probes, ang espesipiko sa eksperimento labi nga gipauswag.Ang disenyo sa probe sa kinatibuk-an kinahanglan nga makatagbo sa mosunod nga mga kondisyon: ①Ang gitas-on sa probe kinahanglan nga mga 20-40 nga mga base aron masiguro ang espesipiko sa pagbugkos.②Ang sulod sa GC base kay tali sa 40% ug 60% aron malikayan ang pagdoble sa single nucleotide sequence.③ Likayi ang hybridization o overlap sa mga primer.④ Ang kalig-on sa pagbugkos tali sa probe ug sa template mas dako kay sa kalig-on sa pagbugkos tali sa primer ug sa template, mao nga ang Tm value sa probe kinahanglang labing menos 5°C nga mas taas kay sa Tm value sa primer.Dugang pa, ang konsentrasyon sa probe, ang homology tali sa probe ug sa template sequence, ug ang gilay-on tali sa probe ug sa primer tanan adunay epekto sa mga resulta sa eksperimento.
May kalabotan nga mga produkto:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Manufacturer ug Supplier |Foregene (foreivd.com)
Oras sa pag-post: Okt-15-2021
