Sa mga eksperimento sa qPCR, ang disenyo sa primer usa usab ka hinungdanon nga link.Kung ang mga primer angay o dili suod nga may kalabotan sa kung ang kahusayan sa pagpadako nakab-ot sa sukaranan, kung ang mga gipadako nga produkto espesipiko, ug kung ang mga resulta sa eksperimento magamit.
Busa unsaon paghimo sa qPCR primer specificity nga mas maayo?Taas nga amplification efficiency?
Karon, dad-on ka namo sa pagdesinyo sa qPCR primers nga magkauban, ug tugotan ang qPCR primer design nga mahimong episyente nga kahanas sa lore sa mga eksperimento.
Sa diha nga ang pagdesinyo sa qPCR primers, kasagaran pagtagad sa mosunod nga mga punto: primers kinahanglan nga gidisenyo sa tibuok introns kutob sa mahimo, ang produkto gitas-on kinahanglan nga 100-300 bp, ang Tm bili kinahanglan nga duol sa 60°C, ug ang upstream ug downstream primers kinahanglan nga ingon ka duol kutob sa mahimo, ug ang katapusan sa primer kinahanglan nga G o C, ug uban pa maghulat.
1. Disenyo sa mga primer nga naglangkob sa mga intron
Kung nagdesinyo sa mga primer sa qPCR, ang pagpili sa mga primer nga gidisenyo sa tibuuk nga mga intron makapugong sa template sa gDNA nga mapadako, ug ang tanan nga mga produkto nakuha gikan sa pagpadako sa cDNA, sa ingon mawala ang impluwensya sa kontaminasyon sa gDNA.
2. Panguna nga gitas-on
Ang primer nga gitas-on kasagaran tali sa 18-30 nt, ug ang gitas-on sa produkto sa amplification kinahanglang kontrolahon tali sa 100-300 bp kutob sa mahimo.
Kung ang primer mubo ra, kini modala ngadto sa dili piho nga pagpadako, ug kung kini taas kaayo, kini dali nga maporma ang sekondaryang istruktura (sama sa istruktura sa hairpin).Kung ang produkto sa amplification taas kaayo, dili kini angay alang sa reaksyon sa polymerase, nga makaapekto sa kahusayan sa PCR amplification.
3. GC content ug Tm value
Ang sulud sa GC sa mga primer kinahanglan nga kontrolon tali sa 40% ug 60%.Kung kini taas kaayo o ubos kaayo, kini dili maayo sa pagsugod sa reaksyon.Ang GC nga sulod sa forward ug reverse primers kinahanglang duol sa parehas aron makuha ang parehas nga Tm value ug annealing temperature.
Ang Tm value kinahanglan nga tali sa 55-65°C kutob sa mahimo, kasagaran sa 60°C, ug ang Tm value sa upstream ug downstream kinahanglan nga duol sa mahimo, mas maayo nga dili molapas sa 4°C.
4. Likayi ang pagpili sa A sa 3′ nga tumoy sa primer
Kung ang 3′ nga katapusan sa primer wala magkatugma, adunay daghang mga kalainan sa kahusayan sa synthesis sa lainlaing mga base.Kung ang katapusan nga base mao ang A, mahimo usab kini nga magsugod sa kadena nga synthesis bisan sa kaso sa mismatching, ug kung ang katapusan nga base mao ang T Sa diha nga, ang kahusayan sa mismatch induction makunhuran pag-ayo.Busa, likayi ang pagpili sa A sa 3′ nga tumoy sa primer, ug mas maayo nga pilion ang T.
Kung kini usa ka probe primer, ang 5′ nga katapusan sa probe dili mahimong G, tungod kay bisan kung ang usa ka G base konektado sa FAM fluorescent reporter nga grupo, G mahimo usab nga mapalong ang fluorescent signal nga gipagawas sa FAM nga grupo, nga moresulta sa sayup nga negatibo nga mga sangputanan.Pagpakita.
5. Base distribution
Ang pag-apod-apod sa upat ka mga base sa primer mas maayo nga random, paglikay sa labaw pa sa 3 ka sunod-sunod nga G o C sa 3′ katapusan, ug labaw pa sa 3 sunod-sunod nga.Ang G o C dali nga makamugna og pagpares sa GC-rich sequence region.
6. Ang primerong disenyo nga rehiyon kinahanglang maglikay sa komplikadong mga sekondaryang istruktura.
Ang ikaduha nga istruktura nga naporma sa usa ka strand sa produkto sa amplification makaapekto sa hapsay nga pag-uswag sa PCR.Pinaagi sa pagtagna kung adunay usa ka sekundaryong istruktura sa target nga han-ay nga abante, sulayi nga likayan kini nga rehiyon sa disenyo sa mga primer.
7. Ang mga primer mismo ug sa taliwala sa mga primer kinahanglan nga mosulay sa paglikay sa sunod-sunod nga komplementaryong base.
Mahimong walay sunod-sunod nga 4 base nga komplementaridad tali sa primer mismo ug sa primer.Ang primer mismo dili kinahanglan nga adunay usa ka komplementaryong pagkasunod-sunod, kung dili kini mapilo sa kaugalingon aron maporma ang usa ka istruktura sa hairpin, nga makaapekto sa kombinasyon sa annealing sa primer ug template.
Ang komplementaryong mga han-ay dili maglungtad tali sa upstream ug downstream primers.Ang komplementaridad tali sa mga primer makapatunghag mga primer dimer, nga makapakunhod sa kahusayan sa PCR ug gani makaapekto sa quantitative accuracy.Kung dili kalikayan ang primer-dimer ug hairpin structures, ang △G value kinahanglan dili kaayo taas (kinahanglan nga ubos pa sa 4.5 kcal/mol).
8. Gipadako sa mga primer ang target nga piho nga produkto.
Ang katapusang tumong sa qPCR detection mao ang pagsabot sa kadagaya sa target gene.Kung mahitabo ang dili piho nga pagpadako, ang pag-ihap mahimong dili tukma.Busa, human nga ang mga primer gidisenyo, sila kinahanglan nga sulayan pinaagi sa BLAST, ug ang specificity sa mga produkto itandi sa sequence database.
Sunod, among gikuha ang gene sa GAS6 (Growth arrest specific 6) sa tawo isip usa ka pananglitan sa pagdesinyo sa qPCR primers.
01 pangutana gene
Homo GAS6pinaagi sa NCBI.Dinhi, kinahanglan natong hatagan ug pagtagad ang pagtandi sa ngalan sa gene ug mga espisye aron masiguro nga sila managsama.
02 Pangitaa ang han-ay sa gene
(1) Kung ang target sequence mao ang genomic DNA, pilia ang una, nga mao ang genomic DNA sequence sa gene.
(2) Kung ang target nga han-ay mao ang mRNA, pilia ang ikaduha.Pagkahuman sa pagsulod, i-klik ang "CDS" sa lamesa sa ubos.Ang brown nga background sequence mao ang coding sequence sa gene.
03 Mga primerong disenyo
Pagsulod sa Primer-BLAST interface
Isulod ang gene sequence number o ang sequence sa Fasta format sa ibabaw nga wala, ug pun-a ang may kalabutan nga mga parameter.

Pag-klik sa "Pagkuha mga primer" ug ang NCBI mo-pop up aron isulti kanimo nga ang ingon nga pagpili sa parameter mapadako sa ubang mga variant sa splicing.Mahimo natong susihon ang lainlaing mga variant sa splicing ug isumite kini aron makuha ang angay nga pares sa primer (sama sa gipakita sa numero sa ubos).Kini nga proseso mahimong mokabat ug napulo ka segundo aron modagan.
Ang annealing nga temperatura niining mga primera nga pares kay halos 60°C.Sumala sa katuyoan sa eksperimento, pilia ang mga primer nga adunay kasarangan nga gitas-on, maayo nga espesipiko ug dili kaayo pagpuno sa kaugalingon sa mga primer para sa eksperimento, ug ang rate sa kalampusan medyo taas!
04Primer specificity verification
Sa tinuud, dugang sa pagdesinyo sa mga primer, ang Primer-Blast mahimo usab nga magtimbang-timbang sa mga primer nga among gidesinyo sa among kaugalingon.Balik sa panid sa primerong disenyo, pagsulod sa upstream ug downstream nga mga primera nga among gidesinyo, ug ang ubang mga parameter dili ma-adjust.Human sa pagsumite, imong makita kung ang parisan sa mga primer anaa usab sa ubang mga gene.Kung ang tanan niini gipakita sa gene nga gusto namong padaghanon , nga nagpakita nga ang espesipiko niining parisan sa mga primera maayo!(Pananglitan, kini ra ang resulta sa primer nga pangutana!)

05 Panguna nga kalidad nga paghukom
Unsa nga klase sa primer ang "perpekto" nga primer nga naghiusa sa "pagpadako nga kahusayan hangtod sa sukaranan", "gipadako nga mga kinaiya sa produkto", ug "kasaligan nga mga resulta sa eksperimento"?
Episyente sa amplification

pagkatunaw nga kurba
Ang pagkaayo sa amplification sa mga primer moabot sa 90% -110%, nga nagpasabot nga ang amplification efficiency maayo, ug ang melting curve adunay usa ka peak ug kasagaran Tm> 80 ° C, nga nagpasabot nga ang amplification specificity maayo.
 
May Kalabutan nga mga Produkto:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Tinuod nga Oras nga PCR Easy-Taqman