Ang teknolohiya sa pagdayagnos sa molekula naggamit sa mga pamaagi sa biology sa molekula aron mahibal-an ang ekspresyon ug istruktura sa genetic nga materyal sa lawas sa tawo ug lainlaing mga pathogen, aron makab-ot ang katuyoan sa pagtagna ug pagdayagnos sa mga sakit.

Sa bag-ohay nga mga tuig, sa pag-upgrade ug pag-uli sa teknolohiya sa molekular nga diagnostic, ang klinikal nga aplikasyon sa mga diagnostic sa molekula nahimong labi ug labi ka halapad ug lawom, ug ang merkado sa molekular nga diagnostic nakasulod sa usa ka panahon sa paspas nga pag-uswag.

Gisumaryo sa tagsulat ang sagad nga mga teknolohiya sa diagnostic sa molekula sa merkado, ug gibahin sa tulo ka bahin: ang una nga bahin nagpaila sa teknolohiya sa PCR, ang ikaduha nga bahin nagpaila sa teknolohiya sa nucleic acid isothermal amplification, ug ang ikaduha nga bahin nagpaila sa teknolohiya sa pagsunud.

01

Bahin I: Teknolohiya sa PCR

teknolohiya sa PCR

Ang PCR (polymerase chain reaction) maoy usa sa in vitro DNA amplification technologies, nga adunay kasaysayan nga kapin sa 30 ka tuig.

Ang teknolohiya sa PCR gipayunir niadtong 1983 ni Kary Mullis sa Cetus, USA.Nag-aplay si Mullis alang sa usa ka patente sa PCR kaniadtong 1985 ug gipatik ang una nga papel sa akademiko sa PCR sa Science sa parehas nga tuig.Si Mullis nakadaog sa Nobel Prize sa Chemistry niadtong 1993.

Pangunang mga Prinsipyo sa PCR

Ang PCR makapadako sa target nga mga tipik sa DNA sa kapin sa usa ka milyon ka beses.Ang prinsipyo mao nga ubos sa catalysis sa DNA polymerase, ang parent strand nga DNA gigamit isip template, ug ang usa ka espesipikong primer gigamit ingon nga punto sa pagsugod sa extension.Gisundog kini sa vitro pinaagi sa mga lakang sama sa denaturation, annealing, ug extension.Ang proseso sa anak nga babaye strand DNA komplementaryo sa ginikanan strand template DNA.

Ang standard nga proseso sa PCR gibahin sa tulo ka mga lakang:

1. Denaturasyon: Gamita ang taas nga temperatura sa pagbulag sa DNA double strands.Ang hydrogen bonds tali sa DNA double strands nabuak sa taas nga temperatura (93-98°C).

2. Annealing: Human mabulag ang double-stranded DNA, ang temperatura ipaubos aron ang primer makabugkos sa single-stranded DNA.

3. Extension: Ang DNA polymerase nagsugod sa pag-synthesize sa mga complementary strand subay sa DNA strands gikan sa mga primer nga gigapos kung ang temperatura gipaubos.Sa dihang makompleto na ang extension, mahuman ang usa ka siklo, ug ang gidaghanon sa mga tipik sa DNA modoble.

Ang pagbalos niining tulo ka mga lakang 25-35 ka beses, ang gidaghanon sa mga tipik sa DNA modaghan pag-ayo.

Ang kinaadman sa PCR mao nga ang lainlaing mga primer mahimong gidisenyo alang sa lainlaing target nga mga gene, aron ang target nga mga tipik sa gene mahimong mapadako sa mubo nga panahon.

Sa pagkakaron, ang PCR mahimong bahinon sa tulo ka kategorya, nga mao ang ordinary PCR, fluorescent quantitative PCR ug digital PCR.

Ang unang henerasyon sa ordinaryo nga PCR

Paggamit ug ordinaryo nga instrumento sa pagpadako sa PCR aron mapadako ang target nga gene, ug dayon gamita ang agarose gel electrophoresis aron mahibal-an ang produkto, ang pagtuki sa kwalitatibo lamang ang mahimo.

Ang mga nag-unang disbentaha sa unang henerasyon nga PCR:

- Prone sa dili piho nga pagpadako ug sayup nga positibo nga mga sangputanan.

-Ang pagkakita nagkinahanglan og taas nga panahon ug ang operasyon lisud.

-Ang qualitative testing ra ang mahimo.

Ikaduha nga henerasyon nga fluorescence quantitative PCR

Ang Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), nailhan usab nga qPCR, gigamit sa pag-monitor sa akumulasyon sa mga amplified nga mga produkto pinaagi sa pagtipon sa mga fluorescent signal pinaagi sa pagdugang sa fluorescent probes nga mahimong magpaila sa pag-uswag sa reaksyon nga sistema, ug sa paghukom sa mga resulta pinaagi sa fluorescence curve, ug Kini mahimong masukod sa tabang sa Cq value ug standard curve.

Tungod kay ang teknolohiya sa qPCR gihimo sa usa ka sirado nga sistema, ang kalagmitan sa kontaminasyon mikunhod, ug ang fluorescence signal mahimong ma-monitor alang sa quantitative detection, mao nga kini ang labing kaylap nga gigamit sa clinical practice ug nahimong dominanteng teknolohiya sa PCR.

Ang mga fluorescent substance nga gigamit sa real-time nga fluorescent quantitative PCR mahimong bahinon ngadto sa: TaqMan fluorescent probes, molekular beacon ug fluorescent dyes.

1) TaqMan fluorescent probe:

Atol sa pagpadako sa PCR, usa ka piho nga fluorescent probe ang idugang samtang nagdugang usa ka pares sa mga primer.Ang probe usa ka oligonucleotide, ug ang duha ka tumoy gimarkahan sa usa ka tigbalita nga fluorescent nga grupo ug usa ka quencher fluorescent nga grupo.

Sa diha nga ang probe mao ang intact, ang fluorescent signal nga gipagawas sa reporter grupo masuhop sa quenching grupo;sa panahon sa PCR amplification, ang 5′-3′ exonuclease nga kalihokan sa Taq enzyme nagbuak ug nagpaubos sa probe, nga naghimo sa reporter nga fluorescent nga grupo ug quencher Ang fluorescent nga grupo gibulag, aron ang fluorescence monitoring system makadawat sa fluorescence signal, nga mao, sa matag higayon nga ang DNA strand gipadako, usa ka fluorescent nga pagporma sa fluorescent nga molekula ang bug-os nga naporma, usa ka fluorescent nga pagporma sa fluorescent nga molekula. ang produkto sa PCR.

2) SYBR fluorescent tina:

Sa sistema sa reaksyon sa PCR, ang sobra sa SYBR fluorescent dye gidugang.Human ang SYBR fluorescent dye dili espesipikong gilakip sa DNA double-strand, kini nagpagawas ug fluorescent signal.Ang molekula sa tina nga SYBR nga wala gilakip sa kadena dili magpagawas sa bisan unsang fluorescent signal, sa ingon masiguro ang fluorescent signal Ang pagtaas sa mga produkto sa PCR hingpit nga na-synchronize sa pagtaas sa mga produkto sa PCR.Ang SYBR mogapos lang sa double-stranded nga DNA, mao nga magamit ang melting curve aron mahibal-an kung espesipiko ba ang reaksyon sa PCR.

3) Molecular beacon

Kini usa ka stem-loop nga doble-label nga oligonucleotide nga probe nga nagporma sa usa ka hairpin structure nga mga 8 ka base sa 5 ug 3 ka tumoy.Ang mga han-ay sa nucleic acid sa duha ka tumoy kay komplementaryong gipares, hinungdan nga ang fluorescent nga grupo ug ang quenching nga grupo hugot.Close, dili kini magpatunghag fluorescence.

Human mamugna ang produkto sa PCR, atol sa proseso sa pag-annealing, ang tunga-tunga nga bahin sa molekular nga beacon gipares sa usa ka espesipikong pagkasunod-sunod sa DNA, ug ang fluorescent nga gene gibulag gikan sa quencher gene aron makahimo og fluorescence.

Ang mga nag-unang disbentaha sa ikaduhang henerasyon nga PCR:

Kulang pa ang pagkasensitibo, ug dili tukma ang pagkakita sa ubos nga kopya nga mga espesimen.

Adunay impluwensya sa bili sa background, ug ang resulta dali nga mabalda.

Ikatulong henerasyon nga digital PCR

Ang Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) nagkalkula sa numero sa kopya sa target nga han-ay pinaagi sa end-point detection, ug makahimo sa tukma nga hingpit nga quantitative detection nga walay paggamit sa internal nga mga kontrol ug standard curves.

Ang digital PCR naggamit sa endpoint detection ug wala magdepende sa Ct value (cycle threshold), mao nga ang digital PCR reaction dili kaayo maapektuhan sa amplification efficiency, ug ang tolerance sa PCR reaction inhibitors gipauswag, nga adunay taas nga katukma ug reproducibility.

Tungod sa mga kinaiya sa taas nga pagkasensitibo ug taas nga katukma, dili kini dali nga mabalda sa mga inhibitor sa reaksyon sa PCR, ug mahimo’g makab-ot ang tinuud nga hingpit nga pag-ihap nga wala’y sukaranan nga mga produkto, nga nahimo’g usa ka panukiduki ug aplikasyon nga hotspot.

Sumala sa lain-laing mga porma sa reaksyon unit, kini mahimong bahinon ngadto sa tulo ka matang: microfluidic, chip ug droplet sistema.