Ang Ct value mao ang pinaka importante nga porma sa presentasyon sa resulta sa fluorescent quantitative PCR.Gigamit kini sa pagkalkulo sa mga kalainan sa ekspresyon sa gene o numero sa kopya sa gene.Busa unsa man ang Ct nga kantidad sa fluorescence quantification nga giisip nga makatarunganon?Giunsa pagsiguro ang epektibo nga sakup sa kantidad sa Ct?

Unsa ang Ct Value?
Atol sa proseso sa pagpadako sa qPCR, ang katugbang nga gidaghanon sa mga siklo sa pagpadako (Cycle Threshold) kung ang signal sa fluorescence sa gipadako nga produkto makaabut sa gitakda nga fluorescence threshold.Ang C nagpasabut sa Cycle ug ang T mao ang Threshold.Sa yano nga pagkasulti, ang Ct nga kantidad mao ang gidaghanon sa mga siklo nga katumbas kung ang una nga pagpadako sa template nakaabot sa usa ka piho nga kantidad sa produkto sa qPCR.Ang gitawag nga "usa ka piho nga kantidad sa produkto" ipatin-aw sa ulahi.

Unsay gibuhat sa Ct value?

1. Relasyon tali sa exponential amplification, template amount ug Ct value
Sa tinuud, ang mga gene sa qPCR natipon pinaagi sa exponential amplification pagkahuman sa pila ka mga siklo.Ang relasyon tali sa gidaghanon sa mga siklo sa pagpadako ug sa gidaghanon sa mga produkto mao ang: Gipadako nga kantidad sa produkto = inisyal nga kantidad sa template × (1+En) nga numero sa mga siklo.Bisan pa, ang reaksyon sa qPCR dili kanunay sa usa ka sulundon nga kahimtang.Kung ang kantidad sa gipadako nga produkto moabot sa usa ka "piho nga kantidad sa produkto", ang gidaghanon sa mga siklo sa kini nga oras mao ang kantidad sa Ct, ug kini naa sa exponential amplification period.Ang relasyon tali sa Ct nga kantidad ug ang kantidad sa pagsugod nga template: Adunay usa ka linear nga relasyon tali sa Ct nga kantidad sa template ug ang logarithm sa sinugdanan nga numero sa kopya sa template.Kon mas taas ang inisyal nga konsentrasyon sa template, mas gamay ang Ct value;mas ubos ang inisyal nga konsentrasyon sa template, mas dako ang Ct value.

2.Amplification curve, fluorescence threshold ug piho nga kantidad sa produkto sa PCR
Ang kantidad sa produkto sa qPCR amplification direkta nga gipresentar sa porma sa fluorescent signal, nga mao, ang amplification curve.Sa sayong bahin sa PCR, ang amplification ubos sa sulundon nga mga kondisyon, ang gidaghanon sa mga siklo gamay, ang produkto nga akumulasyon gamay, ug ang lebel sa fluorescence dili klaro nga mailhan gikan sa fluorescence background.Human niana, ang fluorescence nagdugang ug misulod sa exponential phase.Ang gidaghanon sa produkto sa PCR mahimong mamatikdan sa usa ka punto kung ang reaksyon sa PCR anaa ra sa exponential nga yugto, nga mahimong gamiton isip "usa ka piho nga kantidad sa produkto", ug ang inisyal nga sulod sa template mahimong makuha gikan niini.Busa, ang fluorescence signal intensity katumbas sa usa ka piho nga kantidad sa produkto mao ang fluorescence threshold.

Sa ulahing yugto sa PCR, ang amplification curve dili na magpakita sa exponential amplification, ug mosulod sa linear phase ug plateau phase.

3.Pag-usab sa mga kantidad sa Ct
Kung ang siklo sa PCR nakaabot sa numero sa siklo sa kantidad nga Ct, nakasulod na kini sa tinuud nga exponential amplification period.Niini nga panahon, ang gamay nga sayup wala pa gipadako, mao nga ang reproducibility sa Ct nga bili maayo kaayo, nga mao, ang sama nga template gipadako sa lain-laing mga panahon o sa lain-laing mga tubo sa samang higayon.Pagpadako, ang nakuha nga Ct nga kantidad kanunay.

1.Episyente sa amplification En
Ang PCR amplification efficiency nagtumong sa kaepektibo diin ang polymerase mag-convert sa gene aron mapadako ngadto sa amplicon.Ang kaepektibo sa amplification kung ang usa ka molekula sa DNA mabag-o sa duha nga molekula sa DNA mao ang 100%.Ang kaepektibo sa amplification sagad gipahayag ingon En.Aron mapadali ang pag-analisar sa sunod nga mga artikulo, ang mga hinungdan nga nakaapekto sa pagkaayo sa pagpadako gipaila sa kadali.

2. Range sa Ct values
Ang mga kantidad sa Ct gikan sa 15-35.Kung ang kantidad sa Ct dili mubu sa 15, giisip nga ang pagpadako naa sa sulud sa yugto sa baseline ug ang threshold sa fluorescence wala pa maabot.Sa tinuud, adunay usa ka linear nga relasyon tali sa Ct value ug sa logarithm sa inisyal nga numero sa kopya sa template, nga mao, ang standard curve.Pinaagi sa standard curve, kung ang amplification efficiency mao ang 100%, ang kalkulado nga Ct value alang sa pag-quantify sa single copy number sa gene anaa sa palibot sa 35. Kung kini labaw pa sa 35, ang inisyal nga kopya nga numero sa template kay theoretically less than 1, nga maisip nga walay kahulogan.

Para sa lain-laing gene Ct ranges, tungod sa kalainan sa gene copy number ug amplification efficiency sa inisyal nga template amount, gikinahanglan ang paghimo ug standard curve para sa gene ug kuwentahon ang linear detection range sa gene.

3. Pag-impluwensya sa mga hinungdan sa kantidad sa Ct
Gikan sa relasyon tali sa gidaghanon sa mga siklo sa amplification ug sa gidaghanon sa produkto: kantidad sa gipadako nga produkto = kantidad sa inisyal nga template × (1+En) cycle number, makita nga ubos sa sulundon nga mga kondisyon, ang kantidad sa inisyal nga template ug En adunay negatibong epekto sa Ct value ang maapektuhan.Ang kalainan sa kalidad sa template o kaepektibo sa pagpadako makapahimo sa kantidad sa Ct nga labi ka dako o gamay ra kaayo.

4. Ang kantidad sa Ct dako kaayo o gamay ra kaayo