Ang Real Time PCR, nailhan usab nga quantitative PCR o qPCR, usa ka pamaagi para sa real-time nga pagmonitor ug pagtuki sa mga produkto sa PCR amplification.
Tungod kay ang quantitative PCR adunay mga bentaha sa yano nga operasyon, paspas ug kombenyente, taas nga pagkasensitibo, maayo nga pagbalik-balik, ug ubos nga rate sa kontaminasyon, kini kaylap nga gigamit sa medikal nga pagsulay, pagsusi sa pagkaepektibo sa tambal, panukiduki sa ekspresyon sa gene, panukiduki sa transgenic, pagtuki sa gene, pagtuki sa pathogen, pagtuki sa hayop ug tanum., food testing ug uban pang natad.
Busa, bisan kon ikaw moapil sa mga batakang panukiduki sa mga siyensya sa kinabuhi, o mga empleyado sa mga kompanya sa parmasyutiko, mga kompanya sa pag-atiman sa hayop, mga kompanya sa pagkaon, o bisan mga empleyado sa entry-exit inspection ug mga quarantine bureaus, mga departamento sa pagmonitor sa kinaiyahan, mga ospital ug uban pang mga yunit, mas daghan ka o dili kaayo ma-expose sa O kinahanglan nimo mahibal-an ang kahibalo sa pag-master sa quantitative PCR.

Prinsipyo sa Real Time PCR

Ang Real Time PCR usa ka pamaagi diin ang mga fluorescent substance idugang ngadto sa PCR reaction system, ug ang fluorescence signal intensity sa proseso sa PCR reaction gimonitor sa tinuod nga panahon pinaagi sa quantitative PCR instrument, ug sa kataposan ang experimental data gi-analisa ug giproseso.

【Kurba sa amplification】mao ang kurba nga naghulagway sa dinamikong proseso sa PCR.Ang amplification curve sa PCR dili tinuod nga standard exponential curve, kondili sigmoid curve.

[Platform nga hugna sa amplification curve]Uban sa pagdugang sa gidaghanon sa mga siklo sa PCR, ang dili aktibo nga DNA polymerase, ang pagkunhod sa mga dNTP ug mga primer, ug ang pagdili sa reaksyon sa synthesis pinaagi sa reaksyon sa by-product pyrophosphate, ug uban pa, ang PCR dili kanunay nga molapad sa exponentially., ug sa kadugayan mosulod sa usa ka patag.

[Exponential Growth Rehiyon sa Amplification Curve]Bisan kung ang yugto sa talampas magkalainlain kaayo, sa usa ka piho nga rehiyon sa exponential growth nga rehiyon sa kurba sa amplification, maayo kaayo ang repeatability, nga hinungdanon kaayo alang sa quantitative analysis sa PCR.

[Threshold value ug Ct value]Gibutang namon ang limit nga kantidad sa pagtuki sa fluorescence sa angay nga posisyon sa exponential growth area sa amplification curve, nga mao ang threshold value (Threshold).Ang intersection sa threshold value ug ang amplification curve mao ang Ct value, nga mao, ang Ct value nagtumong sa gidaghanon sa mga cycle (Threshold Cycle) kung maabot ang threshold value.

Ang graph sa ubos klaro nga nagpakita sa relasyon tali sa threshold line ug amplification curve, threshold ug Ct value.

【Unsaon pag-quantify?】

Napamatud-an sa teorya sa matematika nga ang Ct value adunay inverse linear nga relasyon sa logarithm sa gidaghanon sa mga inisyal nga templates.Ang Real Time PCR nagmonitor sa mga produkto sa pagpadako sa PCR sa tinuud nga oras ug gi-quantify kini sa panahon sa exponential amplification phase.

Alang sa matag siklo sa PCR, ang DNA miuswag sa 2 ka beses, ug sa wala madugay nakaabot sa usa ka patag.

Sa pag-ingon nga ang kantidad sa pagsugod sa DNA mao ang A₀ , pagkahuman sa n nga mga siklo, ang teoretikal nga kantidad sa produkto sa DNA mahimong ipahayag ingon:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Dayon, kon mas daghan ang inisyal nga DNA nga kantidad A 0, mas dali ang gidaghanon sa gipadako nga produkto makaabot sa detection value An , ug ang gidaghanon sa mga cycle sa dihang makaabot sa An mao ang Ct value.Sa ato pa, kon mas daghan ang inisyal nga kantidad sa DNA A 0, mas sayo nga mosaka ang kurba sa amplification, ug mas gamay ang gikinahanglang gidaghanon sa mga siklo n.

Naghimo kami og gradient dilution sa sumbanan sa nahibal-an nga konsentrasyon ug gigamit kini ingon usa ka template alang sa Real Time PCR, ug usa ka serye sa mga kurba sa amplification makuha sa parehas nga mga agwat sa han-ay sa pagsugod sa kantidad sa DNA gikan sa labi ka gamay.Sumala sa linear nga relasyon tali sa Ct nga bili ug sa logarithm sa gidaghanon sa pagsugod nga mga templates, a[standard curve] mahimong mabuhat .

Pinaagi sa pag-ilis sa Ct nga kantidad sa sample nga wala mahibal-an nga konsentrasyon sa standard curve, ang inisyal nga template nga kantidad sa sample nga wala mahibal-an nga konsentrasyon mahimong makuha, nga mao ang quantitative nga prinsipyo sa Real Time PCR.

Pamaagi sa pagtuki sa Real Time PCR

Ang Real Time PCR nakamatikod sa mga produkto sa pagpadako sa PCR pinaagi sa pag-ila sa intensity sa fluorescence sa reaksyon nga sistema.

Prinsipyo sa Fluorescent Dye Embedding Method】

Mga tina nga fluorescent, sama sa TB Green ® , mahimong nonspecifically makagapos sa double-stranded DNA sa PCR system ug fluoresce sa paggapos.

Ang intensity sa fluorescence sa reaksyon nga sistema miuswag sa exponentially uban sa pagdugang sa PCR cycles.Pinaagi sa pag-ila sa fluorescence intensity, ang gidaghanon sa DNA amplification sa reaksyon nga sistema mahimong ma-monitor sa tinuod nga panahon, ug unya ang kantidad sa pagsugod template sa sample mahimong reversely gibanabana.

【Prinsipyo sa pamaagi sa fluorescent probe】

fluorescent probemaoy usa ka nucleic acid sequence nga adunay fluorescent group sa 5′ end ug quenching group sa 3′ end, nga espesipikong makagapos sa template.Sa diha nga ang probe intact, ang fluorescence nga gipagawas sa fluorophore gipalong sa quenching nga grupo ug dili fluoresce.Kung ang probe madunot, ang fluorescent substance mobulag ug mopagawas sa fluorescence.

Usa ka fluorescent probe ang idugang sa PCR reaction solution.Atol sa proseso sa annealing, ang fluorescent probe magbugkos sa piho nga posisyon sa template.Atol sa proseso sa extension, ang 5′→3′ exonuclease nga kalihokan sa PCR enzyme mahimong madunot ang fluorescent probe nga hybridized sa template, ug ang fluorescent substance gidissociate aron mopagawas sa fluorescence.Pinaagi sa pag-ila sa fluorescence intensity sa probe sa reaksyon nga sistema, ang katuyoan sa pag-monitor sa amplification nga kantidad sa produkto sa PCR mahimong makab-ot.

【Pagpili sa Fluorescence Detection Method】

Kung kini gigamit sa pag-ila sa mga han-ay nga adunay taas nga homology ug paghimo sa multiplex PCR detection sama sa pag-analisa sa pag-type sa SNP, ang fluorescent probe nga pamaagi dili mapulihan.
Alang sa ubang mga eksperimento sa Real Time PCR, ang usa ka simple, sayon ​​ug barato nga fluorescent chimera nga pamaagi mahimong gamiton.

probesKusog nga espesipiko, makahimo sa multiplex PCR

Kakulangan

Taas nga espesipiko nga mga kinahanglanon alang sa pagpadako;

dili mahimo ang multiplex PCR Kinahanglan nga magdesinyo ug piho nga mga pagsusi, taas nga gasto;

usahay lisod ang disenyo sa probe

May Kalabutan nga mga Produkto: