Ang PCR mao ang labing kaylap nga gigamit nga teknolohiya sa pagpadako sa nucleic acid ug kaylap nga gigamit tungod sa pagkasensitibo ug pagkapili niini.Bisan pa, ang PCR nanginahanglan balik-balik nga thermal denaturation ug dili makuha ang mga limitasyon sa pagsalig sa mga instrumento ug kagamitan, nga naglimite sa aplikasyon niini sa pagsulay sa klinikal nga natad.

Sukad sa sayong bahin sa 1990s, daghang mga laboratoryo ang nagsugod sa pagpalambo sa kanunay nga teknolohiya sa pagpadako sa temperatura nga wala magkinahanglan og thermal denaturation.Karon nakahimo na sila og loop-mediated isothermal amplification technology, strand replacement isothermal amplification technology, rolling circle isothermal amplification technology, ug nucleic acid sequence dependence.Isothermal amplification teknolohiya ug uban pang mga teknolohiya. 

Loop-mediated isothermal amplification

Ang prinsipyo sa pagpadako gibase sa kamatuoran nga ang DNA anaa sa usa ka dinamikong kahimtang sa balanse sa mga 65°C.Kung ang bisan unsang primer gipares sa base ug gipalapdan sa komplementaryong bahin sa double-stranded nga DNA, ang laing strand madissociate ug mahimong single-stranded.

Niini nga temperatura, ang DNA naggamit ug 4 ka espesipikong mga primera aron mosalig sa usa ka strand-displacement DNA polymerase aron himoon ang synthesis sa strand-displacement nga DNA nga padayon nga magpalibot sa kaugalingon.

Tinoa una ang 6 ka espesipikong rehiyon F3, F2, F1, B1, B2, B3 sa target nga gene, ug dayon pagdesinyo ug 4 ka primer base niining 6 ka espesipikong rehiyon (sama sa gipakita sa hulagway sa ubos):

Ang forward inner primer (FIP) gilangkoban sa F1c ug F2.

Ang backward inner primer (BIP) gilangkuban sa B1c ug B2, ug ang TTTT gigamit isip spacer sa tunga.

Ang gawas nga mga primer F3 ug B3 gilangkuban sa F3 ug B3 nga mga rehiyon sa target nga gene.

Sa sistema sa reaksyon sa LAMP, ang konsentrasyon sa sulod nga primer daghang beses kaysa sa gawas nga primer.Ang sulod nga primer una nga gikombinar sa template strand aron ma-synthesize ang complementary strand aron maporma ang DNA double strand.Pagkahuman, ang gawas nga primer gihiusa sa template strand aron maporma ang usa ka doble nga strand sa DNA.Ubos sa aksyon sa BstDNA polymerase, ang komplementaryong strand nga gi-synthesize sa sulod nga primer gipagawas.Human sa sunodsunod nga mga reaksyon, ang complementary strand sa kataposan nahimong usa ka DNA strand nga adunay dumbbell structure.

Ang dumbbell structure DNA single strand mismo gigamit isip template aron padayon nga maporma ang transitional stem-loop structure DNA nga adunay bukas nga tumoy.Ang sulod ug gawas nga mga primer naggiya sa transitional stem-loop structure DNA aron padayon nga moagi sa strand displacement ug extension nga mga reaksyon, ug sa kataposan maporma ang daghang stem-loop structures nga lainlain ang gitas-on.Sagol nga DNA.

Mga bentaha ug disbentaha sa loop-mediated isothermal amplification

Mga bentaha sa LAMP:

(1) Taas nga amplification efficiency, nga epektibong makapadako sa 1-10 ka kopya sa target nga gene sulod sa 1h, ug ang amplification efficiency maoy 10-100 ka pilo sa ordinaryo nga PCR.

(2) Ang panahon sa reaksyon mubo, ang espesipiko lig-on, ug walay espesyal nga kagamitan ang gikinahanglan.

Mga kakulangan sa LAMP:

(1) Ang mga kinahanglanon alang sa mga primer labi ka taas.

(2) Ang gipadako nga produkto dili magamit alang sa pag-clone ug pagsunud-sunod, apan magamit ra alang sa paghukom.

(3) Tungod sa kusog nga pagkasensitibo niini, dali nga maporma ang mga aerosol, hinungdan sa mga sayup nga positibo ug makaapekto sa mga resulta sa pagsulay.

Spagpadako sa pagbalhin sa trand

Ang Strand displacement amplification (SDA) usa ka in vitro isothermal DNA amplification technique base sa enzymatic reaction nga unang gisugyot sa American scholar Walker niadtong 1992.

Ang batakang sistema sa SDA naglakip sa restriction endonuclease, DNA polymerase nga adunay strand displacement activity, duha ka parisan sa primers, dNTPs, ug calcium ug magnesium ions ug buffer system.

Ang prinsipyo sa strand displacement amplification gibase sa chemically modified restriction endonuclease recognition sequence sa duha ka tumoy sa target DNA.Ang endonuclease moabli sa gintang sa strand DNA sa iyang recognition site, ug ang DNA polymerase molugway sa gintang nga 3′ End ug mopuli sa sunod nga DNA strand.

Ang gipulihan nga single strands sa DNA mahimong ikombinar sa primers ug ipaabot ngadto sa double strands pinaagi sa DNA polymerase.Kini nga proseso padayon nga gisubli, aron ang target nga han-ay maayo nga mapadako.

Mga bentaha ug disbentaha sa teknolohiya sa pagpadako sa strand displacement

Mga bentaha sa SDA:

Taas ang kahusayan sa amplification, mubo ang oras sa reaksyon, lig-on ang espesipiko, ug wala’y kinahanglan nga espesyal nga kagamitan.

Mga kakulangan sa SDA:

Ang mga produkto dili uniporme, ug ang pipila ka single-stranded ug double-stranded nga mga produkto kanunay nga gihimo sa SDA cycle, ug ang tailing dili kalikayan nga mahitabo kung mamatikdan sa electrophoresis.

Rolling circle amplification

Ang rolling circle amplification (RCA) gisugyot pinaagi sa pagdrowing sa pamaagi sa pagkopya sa DNA gikan sa pathogenic organisms pinaagi sa rolling circle.Kini nagtumong sa paggamit sa single-stranded circular DNA ingon nga usa ka template sa usa ka kanunay nga temperatura, ug usa ka espesyal nga DNA polymerase (sama sa Phi29) ) Ubos sa aksyon sa rolling sirkulo DNA synthesis aron makab-ot ang pagpadako sa target nga gene.

Ang RCA mahimong bahinon sa linear amplification ug exponential amplification.Ang kahusayan sa linear RCA mahimong moabot sa 10⁵mga panahon, ug ang kahusayan sa exponential RCA mahimong moabot sa 10⁹mga panahon.

Yano nga kalainan, sama sa gipakita sa hulagway sa ubos, linear amplification a naggamit lang ug 1 primer, exponential amplification b adunay 2 primers.

Ang linear RCA gitawag usab nga single primer RCA.Ang usa ka primer nagbugkos sa circular DNA ug gipalapdan pinaagi sa aksyon sa DNA polymerase.Ang produkto usa ka linear nga single strand nga adunay daghang gidaghanon sa mga balik-balik nga pagkasunod-sunod nga liboan ka beses ang gitas-on sa usa ka loop.

Tungod kay ang produkto sa linear RCA kanunay nga konektado sa pagsugod nga primer, ang dali nga pag-ayo sa signal usa ka hinungdanon nga bentaha.

Ang exponential RCA, nailhan usab nga Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), sa exponential RCA, ang usa ka primer nagpadako sa produkto sa RCA, ang ikaduha nga primer nag-hybrid sa produkto sa RCA ug naglugway, ug ang pag-ilis gigapos na sa RCA nga produkto Ang downstream primers nagpalugway sa strand, ug gisubli ang extension ug pag-ilis aron makagama og dendritic nga produkto nga RCA.

Ang mga bentaha ug disbentaha sa rolling circle nucleic acid amplification

Mga bentaha sa RCA:

Taas nga pagkasensitibo, maayo nga espesipiko ug dali nga operasyon.

Mga kakulangan sa RCA:

Mga problema sa background sa panahon sa pag-detect sa signal.Atol sa reaksyon sa RCA, ang wala malibot nga padlock probe ug ang template nga DNA o RNA sa wala mabugkos nga probe mahimong makamugna og pipila ka mga signal sa background. 

Nucleicacid sequence-based amplification

Ang nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) usa ka bag-ong teknolohiya nga naugmad base sa PCR.Kini usa ka padayon ug isothermal nucleic acid amplification nga gigiyahan sa usa ka parisan sa mga primer nga adunay T7 promoter sequence.Ang teknolohiya makapadako sa template nga RNA sa mga 109 ka beses sa mga 2 ka oras, nga 1000 ka beses nga mas taas kaysa sa naandan nga PCR nga pamaagi ug wala magkinahanglan ug espesyal nga kagamitan.

Kini nga teknolohiya gigamit alang sa paspas nga pagdayagnos sa mga sakit sa diha nga kini nagpakita, ug daghang mga kompanya karon ang naggamit niini nga pamaagi sa RNA detection kits.

Bisan kung ang RNA amplification mahimo usab nga mogamit sa reverse transcription PCR nga teknolohiya, ang NASBA adunay kaugalingon nga mga bentaha: mahimo kini sa ilawom sa medyo kanunay nga kahimtang sa temperatura, ug kini mas lig-on ug tukma kaysa tradisyonal nga teknolohiya sa PCR.

Ang reaksyon anaa sa 41 degrees Celsius ug nagkinahanglan sa AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase ug usa ka parisan sa mga primer para makompleto.

Ang proseso nag-una naglakip sa:

Ang unahan nga primer naglangkob sa komplementaryong han-ay sa T7 promoter.Atol sa reaksyon, ang forward primer nagbugkos sa RNA strand ug gi-catalyzed sa AMV enzyme aron maporma ang DNA-RNA double strand.

Gitunaw sa RNase H ang RNA sa hybrid double-strand ug gipabilin ang single-stranded DNA.

Ubos sa aksyon sa reverse primer ug sa AMV enzyme, usa ka DNA double strand nga adunay T7 promoter sequence naporma.

Ubos sa aksyon sa T7 RNA polymerase, ang proseso sa transkripsyon nahuman ug usa ka dako nga kantidad sa target nga RNA ang gihimo.

Mga bentaha sa NASBA:

(1) Ang primer niini adunay T7 promoter sequence, apan ang langyaw nga double-stranded DNA walay T7 promoter sequence ug dili mapadako, mao nga kini nga teknolohiya adunay taas nga specificity ug sensitivity.

(2) Direkta nga gilakip sa NASBA ang reverse transcription nga proseso ngadto sa amplification reaction, pagpamubo sa oras sa reaksyon.

Mga disbentaha sa NASBA:

(1) Ang mga sangkap sa reaksyon mas komplikado.

(2) Tulo ka matang sa mga enzyme ang gikinahanglan aron mas taas ang gasto sa reaksyon.