Ang RT-qPCR mao ang sukaranan nga eksperimento sa molecular biology, ug ang tanan kinahanglan nga pamilyar niini.Nag-una kini sa tulo ka mga lakang: RNA extraction, reverse transcription ngadto sa cDNA, ug real-time nga fluorescent quantitative PCR.Dili kini makatabang, unsa ang nahitabo?Kini lagmit nga adunay problema saang reverse transcription nga eksperimento!Bisan kung ang reverse transcription nga eksperimento kinahanglan lamang nga idugang ang RNA, dNTP, primer, ugreverse transcriptasengadto sa centrifuge tube ug maayo ang pagsagol, apan sa aktuwal nga proseso sa operasyon, adunay daghan pa nga mga detalye nga kinahanglan nga hatagan ug pagtagad.Atong tun-an kini!

Giunsa paghukom ang kalidad sa RNA?
Aron makuha ang cDNA, ang kalidad sa RNA kritikal!Ang kalidad sa RNA makita sa panguna gikan sa duha ka aspeto:
(1) Integridad sa RNA:Ang integridad sa RNA mahimong mapamatud-an pinaagi sa agarose gel electrophoresis. Ang pagkuha sa mga eukaryote isip usa ka pananglitan, ang kompletong kinatibuk-ang RNA adunay tulo ka tin-aw nga mga banda, ang molekular nga gibug-aton gikan sa dako ngadto sa gamay mao ang 28S, 18S, ug 5S, ug ang 28S doble sa kahayag sa 18S;kung makita ang tulo ka mga banda, apan ang tipo sa banda blur o ang Diffusion nagpasabut nga ang RNA kay partially degraded.Niining panahona, palihog himoa dayon ang reverse transcription reaction ug dugangi ang template input sa tukmang paagi;kung ang usa ka banda nga adunay gamay nga gibug-aton sa molekula o wala’y banda ang makita, ang RNA hingpit nga nadaot ug kinahanglan nga kuhaon pag-usab.Ang Agilent 2100 nagpakita sa integridad sa RNA nga adunay peak diagram ug RIN value.Kung ang nucleic acid wala'y sulod, ang baseline sa electropherogram patag;kung ang nucleic acid grabe nga nadaot, ang baseline dili patas ug daghang mga peak sa pagkadaot ang makita;ang bili sa RIN nagpakita sa integridad sa RNA, sulod sa han-ay sa 0-10, mas dako ang bili, mas maayo ang kalidad sa RNA.Aw, mas taas ang lebel sa pagkakompleto.
(2) Kaputli sa RNA:Ang ratio sa OD260/280 mahimong mamatikdan sa UV spectrophotometry.Kung ang ratio sa OD260/280 anaa sa taliwala sa 1.9 ug 2.1, ang kaputli maayo kaayo.
Ang nahabilin nga genomic DNA mahimong mosangpot sa dili tukma nga mga resulta sa gidaghanon
Kung makuha ang RNA, ang RNA nga atong makuha mahimong isagol sa genomic DNA (gDNA) nga wala pa malimpyohan.Busa, ang cDNA human sa reverse transcription isagol usab sagDNA.Atol sa ubosqPCRreaksyon,cDNAug ang gDNA mahimong dungan nga mapadako, nga moresulta sa medyo gamay nga kantidad sa CT, mao nga ang mga resulta mahimong mapihigon.
Busa unsay angay natong buhaton niini nga sitwasyon?Foregenenagsugyot:
(1) Paghimo og genome nga paglimpyo sa nabalik nga RNA, nga mahimong tangtangon pinaagi sa column extraction atol sa RNA extraction;
(2) Pagtratar sa gikuha nga RNA gamit ang DNaseI , apan tapuson kini sa EDTA;
sa reverse transcription reagentsnga adunay genome clearing modules ;

Giunsa pagpili ang mga primer para sa reverse transcription?
Ang reverse transcription primers makaapekto usab sa resulta sa reverse transcription reaction.Makapili ka ug random primers, Oligo dT o gene-specific primers para sa reverse transcription sumala sa piho nga mga sirkumstansya sa eksperimento:
(1) Piho nga mga transcript: girekomendar ang mga primerong espesipiko sa gene;
(2) Taas nga mga transcript sa tipik: Oligo dT/gene-specific primers girekomendar;
(3) Internal nga mga tipik sa taas nga bahin nga mga transcript: gene-specific primers/ random primers / random primers + Oligo dT.Kung ang sunod nga eksperimento sa qPCR gihimo, ang Oligo dT dili magamit nga mag-inusara, tungod kay ang paggamit sa Oligo dT nga mag-inusara mahimong hinungdan sa 3′ end bias, nga mosangpot sa dili tukma nga mga resulta sa eksperimento sa qPCR;
(4) miRNA: Mahimong gamiton ang stem-loop primers o tailing primers.

Pila ka beses nga ang reverse transcription product cDNA lasaw para sa quantification?
Human makuha ang cDNA sa reverse transcription product, pila ka beses ang cDNA kinahanglan nga lasaw para sa qPCR nga mga eksperimento importante kaayo.Kung ang konsentrasyon sa cDNA labi ka taas o ubos kaayo, ang kahusayan sa pagpadako mahimong maapektuhan.Masukod ba ang konsentrasyon sa cDNA, ug unsaon kini pagbuhat?
(1) Ang konsentrasyon sa cDNA sa reverse transcription nga produkto dili masukod, tungod kay dugang pa sa produkto sa cDNA, ang reverse transcription nga produkto naglakip usab sa reverse transcription residual Buffer, reverse transcriptase, primers, ug uban pa, nga makabalda sa mga resulta sa pagsukod sa konsentrasyon ug hinungdan sa OD260/280, OD260/230 ang dili normal nga ratio sa cD.Niining panahona, ang ubang mga higala moingon, unya akong sukdon ang konsentrasyon human sa pagputli;dinhi,Foregene gusto sa pagpahinumdom nga ang cDNA dili girekomendar sa pagputli, tungod kay ang gitas-on sa cDNA nga nakuha pinaagi sa pagbalik-balik mao ang lain-laing, ug ang mubo nga cDNA mawala sa pagputli.
(2) Busa unsay buhaton?Sa wala pa ang eksperimento sa qPCR, ang dilution gradient sa cDNA mahimong matino pinaagi sa pre-eksperimento.Pananglitan: gamita ang cDNA stock solution, 10-fold dilution, ug 100-fold dilution isip templates para sa qPCR experiments, ug pilia ang dilution factor nga adunay CT value sa range nga 18-28.

Sa unsa nga paagi nga ang mga miRNA mahimong balihon nga pag-transcribe?
Ang miRNA usa ka single-stranded nga gamay nga molekula nga RNA nga adunay gidak-on nga mga 22 nt nga wala mag-code alang sa protina.Tungod sa mubo nga gitas-on niini, ang naandan nga pamaagi sa qPCR lisud nga direkta nga ma-ihap kini, mao nga kanunay kinahanglan nga i-extend ang miRNA;ang kasagarang gigamit nga reverse transcription method para sa miRNA naglakip sa stem-loop method ug tailing method.
Ang pamaagi sa stem-loop mao ang pagpalapad sa miRNA pinaagi sa pagdugang sa stem-loop primers.Kini nga pamaagi sa pag-ila adunay mas taas nga pagkasensitibo ug pagka-espesipiko, apan ang pagtuki sa throughput gamay.Ang usa ka reverse transcription makamatikod lamang sa usa ka miRNA ug usa ka internal nga reperensiya;ang pamaagi sa pagdugang sa ikog gilangkuban sa duha Kini nakompleto pinaagi sa hiniusang aksyon sa duha ka mga enzyme, nga mao ang PolyA polymerase ug reverse transcriptase.Ang PolyA polymerase maoy responsable sa pagdugang sa PolyA nga mga ikog sa miRNA aron madugangan ang gitas-on niini, ug ang reverse transcriptase mohimo ug reverse transcription reaction.Kini nga pamaagi adunay taas nga detection throughput ug makamatikod sa daghang miRNA ug internal nga mga reperensiya sa usa ka reverse transcription, apan ang pagkasensitibo ug espesipiko ubos sa stem-loop nga pamaagi.