PCR, daghan PCR, Sa dapit PCR, Balika ang PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Atong hisgotan ang mga konsepto, lakang ug mga detalye sa lain-laing PCR

Ⅰ. PCR

Ang Polymerase Chain Reaction, nga gitawag nga PCR, usa ka molecular biological nga teknolohiya nga gigamit sa pagpadako sa piho nga mga tipik sa DNA.Mahimo kini isipon nga usa ka espesyal nga replikasyon sa DNA sa vitro.Ang DNA polymerase (DNA Polymerase I) nadiskobrehan sa sayo pa sa 1955, ug ang Klenow Fragment sa E. Coli, nga adunay eksperimento nga bili ug pagkapraktikal, nadiskobrehan ni Dr. H. Klenow sa sayong bahin sa 1970s, apan tungod kay kini nga enzyme dili motugot sa temperatura, ang taas nga temperatura makadaut niini, mao nga kini dili makatagbo sa taas nga temperatura nga degeneration reaction sa polymerasegene chain reaction.Ang mga enzyme nga gigamit karon (gitawag nga Taq polymerase), nahimulag gikan sa Thermus aquaticus, usa ka hot spring bacterium niadtong 1976. Ang kinaiya niini mao nga kini makasukol sa taas nga temperatura ug usa ka sulundon nga enzyme, apan kini kaylap nga gigamit human sa 1980s.Ang orihinal nga konsepto sa orihinal nga primitive prototype sa PCR susama sa pag-ayo ug pagkopya sa gene, nga gisugyot ni Dr. KJell Kleppe niadtong 1971. Iyang gipatik ang una nga simple ug mubo nga panahon nga kopya sa gene (susama sa unang duha ka siklo nga reaksyon sa PCR).Ang PCR nga naugmad karon gimugna ni Dr. Kary B. Mullis niadtong 1983. Si Dr. Mullis nagserbisyo sa mga kompanya sa PE nianang tuiga, busa ang PE adunay espesyal nga kahimtang sa industriya sa PCR.Opisyal nga gipatik ni Dr. Mullis ang unang may kalabotan nga papel uban sa Saiki ug uban pa niadtong 1985. Sukad niadto, ang paggamit sa PCR libolibo ka milya kada adlaw, ug ang kalidad sa may kalabotan nga mga papel mahimong ikaingon nga naghimo sa daghang uban pang mga pamaagi sa panukiduki nga dili maayo.Pagkahuman, ang teknolohiya sa PCR kaylap nga gigamit sa biolohikal nga siyentipikong panukiduki ug klinikal nga aplikasyon, nga nahimong labing hinungdanon nga teknolohiya sa panukiduki sa molekular nga biology.Nadaog usab ni Mullis ang 1993 Nobel Prize sa Chemistry.

PCRPrinsipyo

Ang sukaranang prinsipyo sa teknolohiya sa PCR susama sa natural nga proseso sa pagkopya sa DNA, ug ang espesipiko niini nagdepende sa primerong oligonucleotide nga komplementaryo sa duha ka tumoy sa target sequence.Ang PCR gilangkuban sa degeneration-annealing-extending tulo ka batakang mga reaksyon nga mga lakang: ①Degeneration sa template DNA: Human ang template DNA gipainit sa mga 93°C sulod sa usa ka piho nga yugto sa panahon, ang dual DNA solution alang sa dual-chain DNA nga naporma pinaagi sa PCR amplification sa template nga DNA Pagbiya, himoa kini nga usa ka kadena aron kini maandam sa sunod nga hugna sa reaksyon.②Ang annealing (compound) sa template DNA ug ang primer: Human ang template nga DNA mapainit ug madaot ngadto sa usa ka kadena, ang temperatura mous-os ngadto sa mga 55°C.Ang komplementaryong han-ay sa primer ug ang template nga DNA single-chain.③Ang extension sa primer: DNA template-ang primer binding gibase sa aksyon sa TaqDNA polymerase, uban ang dNTP isip reaction raw material.Hupti ang prinsipyo sa pagkopya, pag-synthesize og bag-ong semi-reserved nga kopya nga kadena nga mokomplemento sa template nga DNA chain, ug balik-balik ang cycle degeneration-annealing-extension tulo ka proseso makakuha og dugang nga "semi-reserved copy chain", ug kining bag-ong kadena magamit na usab Mahimong template para sa sunod nga cycle.Nagkinahanglan kini og 2-4min aron makompleto ang loop, ang target nga gene mahimong mapadako sa daghang milyon nga beses sa 2-3 ka oras.

EstandardPCRSistema sa Reaksyon

Lima ka elemento sa reaksyon sa PCR

Adunay nag-una nga lima ka matang sa mga substansiya nga nalambigit sa PCR reaction, nga mao ang primer, enzyme, dNTP, template ug buffer (Mg2+ ang gikinahanglan).[Paagi sa PCR]

Ang standard nga proseso sa PCR gibahin sa tulo ka mga lakang

1. DNA degeneration (90°C-96°C): Dual-chain DNA templates ubos sa thermal action, hydrogen bonds nabuak, nga nahimong single-chain DNA.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Ang temperatura sa sistema gipakunhod, ang primer gihiusa uban sa template sa DNA aron mahimong usa ka lokal nga dual-chain.

3. Extension (70 ℃ -75 ℃): Ubos sa aksyon sa Taq enzyme (mga 72 ° C, ang labing maayo nga kalihokan), ang dNTP gigamit ingon nga hilaw nga materyal, gikan sa 5′ nga tumoy sa primer → 3′ nga katapusan, ang synthesis ug template nagsuporta sa usag usa nga kadena sa DNA.

Ang matag siklo gi-denatured, gi-annealed ug gipalugway, nga nagdoble sa sulod sa DNA.Sa pagkakaron, tungod sa mubo nga lugar sa amplification, ang pipila ka PCR mahimong makopya sa mubo nga panahon bisan kung ang kalihokan sa Taq enzyme dili kamahinungdanon, mao nga kini mahimong mausab ngadto sa duha ka mga lakang, nga mao, ang annealing ug extension mahimong ipahigayon sa 60 ° C-65 ° C sa samang higayon.Aron makunhuran ang proseso sa pagbayaw ug pagpabugnaw ug pagpaayo sa katulin sa pagtubag.

Mga bahin sa PCR Reaction

● High-Specificity

Ang piho nga mga hinungdan sa tubag sa PCR mao ang: ①Ang piho nga kombinasyon sa primer ug sa template nga DNA.②Ang prinsipyo sa pagpares sa base.③Ang pagkamaunongon sa TaqDNA polymerase synthesis reaction.④Ang espesipiko ug konserbatibo sa target nga gene.

Ang husto nga kombinasyon sa mga primer ug templates mao ang yawe.Ang pagbugkos sa primer ug ang template ug ang extension sa primer chain gibase sa prinsipyo sa alkaline base matching.Ang pagkamaunongon sa polymerase synthesis nga mga reaksyon ug ang taas nga temperatura nga pagsukol sa Taq DNA polymerase aron mahimo ang pagbugkos (compound) sa template ug primer sa reaksyon mahimong ipahigayon sa mas taas nga temperatura.Ang espesipiko sa kombinasyon nadugangan pag-ayo.Ang clip makapadayon sa taas nga lebel sa pagkatul-id.Pinaagi sa pagpili sa usa ka target nga genetic nga rehiyon nga adunay taas nga pagkakonserbatibo ug taas nga pagkakonserbatibo, ang espesipiko niini mas taas.

● Taas nga Pagkasensitibo

Ang gidaghanon sa produksiyon sa mga produkto sa PCR gipataas pinaagi sa indeks, nga makapalapad sa pagsugod nga template sa Picker (PG=10-12) aron madugangan ang lebel sa microcontroller sa lebel sa micrograms (μg= -6).Ang usa ka target nga mga selula mahimong mamatikdan gikan sa 1 ka milyon nga mga selula;sa pagkakita sa mga virus, ang pagkasensitibo sa PCR mahimong moabot sa 3 RFUs (walay sulod nga mga lugar nga naporma nga mga yunit);ang minimum nga detection rate sa bacterial science kay 3 bacteria.

● Yano ug Kusog

Ang pagpamalandong sa PCR naggamit ug taas nga temperatura nga Taq DNA polymerase, nga nagdugang sa reaksyon nga solusyon sa usa ka higayon, nga mao, usa ka degeneration-anneal-extension nga reaksyon sa DNA amplification solution ug water bath pot.Sa kinatibuk-an, ang amplification reaksyon makompleto sa 2 ngadto sa 4 ka oras.Ang gipadako nga mga produkto kasagarang analisa pinaagi sa electrical sword, ug dili kinahanglang mogamit ug isotopes, walay radioactive pollution, ug sayon ​​nga promosyon.

● Ang kaputli sa espesimen ubos

Dili kinahanglan nga ibulag ang mga virus o bakterya ug mga selula sa kultura.Ang mga produkto sa krudo sa DNA ug RNA mahimong gamiton isip mga amplifier.Ang DNA amplification detection mahimong gamiton direkta gamit ang clinical specimens sama sa dugo, likido sa lawas, ubo nga panghugas nga likido, buhok, mga selula, ug buhi nga tisyu.

PCRkomon nga mga problema

● False negatibo, walay amplified bands

Ang yawe nga mga yugto sa reaksyon sa PCR naglakip sa: ① pag-andam sa template nucleic acids, ② kalidad ug espesipiko sa mga primer, ③ kalidad sa mga enzyme ④ PCR cycle kondisyon.Ang pagpangita sa hinungdan kinahanglan usab nga analisahon ug tun-an alang sa mga link sa ibabaw.

Mga template: ① Ang template adunay lain-laing protina, ② Ang template adunay Taq enzyme inhibitor, ③ Ang protina sa template wala giwagtang, ilabi na ang grupo nga protina sa chromosome.⑤ Ang deminer nucleic acid degeneration dili hingpit.Kung maayo ang kalidad sa mga enzyme ug primer, wala’y amplification band, nga lagmit ang pagtambal sa digestive sa mga specimen.Adunay usa ka butang nga sayup sa template nga proseso sa pagkuha sa nucleic acid, mao nga aron maandam ang usa ka epektibo ug lig-on nga solusyon sa pagtunaw, ang pamaagi niini kinahanglan nga ayohon ug dili basta-basta nga gibag-o.

Enzyme inactivation: usa ka bag-ong enzyme o pareho nga daan ug bag-ong mga enzyme kinahanglan gamiton nga magkauban aron analisahon kung ang kalihokan sa enzyme nawala o dili igo, nga mosangput sa mga sayup nga negatibo.Kinahanglang hinumdoman nga ang Taq enzyme o ethidium bromide usahay makalimtan.

Primer: ang kalidad sa primer, ang konsentrasyon sa primer, ug kon simetriko ba ang konsentrasyon sa duha ka primer.Kini usa ka kasagarang hinungdan sa kapakyasan sa PCR o ang pagtaas sa banda dili maayo ug dali nga magkatag.Adunay mga problema sa kalidad sa mga primer sa pipila ka mga numero sa batch.Ang duha nga mga primer adunay taas nga konsentrasyon ug usa ka ubos nga konsentrasyon, hinungdan sa ubos nga kahusayan nga asymmetric amplification.Ang mga countermeasure mao ang: ① Pagpili og maayong primer para sa pag-synthesize sa mga unit.② Ang konsentrasyon sa primer dili lamang nagdepende sa OD nga kantidad, apan naghatag usab ug pagtagad sa orihinal nga likido sa primer aron mahimo ang agar sugar gel electrophoresis.Kinahanglan nga adunay usa ka primer strip zone, ug ang kahayag sa duha ka primer kinahanglan nga sa kasagaran makanunayon.Belt, PCR mahimong mapakyas niining panahona, ug kini kinahanglan nga masulbad sa primer synthesis unit.Kung ang usa ka primer taas, ang kahayag gamay, ug ang konsentrasyon niini kinahanglan balanse kung lasaw.③ Ang primer kinahanglan nga bayran ug tipigan sa taas nga konsentrasyon aron mapugngan ang daghang pagyelo o dugay nga mga bahin sa refrigerasyon sa refrigerator, nga maoy hinungdan nga ang primer madaot ug madaot.④ Ang disenyo sa primer dili makatarunganon, sama sa gitas-on sa primer dili igo, ug ang di cluster naporma tali sa mga primer.

Konsentrasyon sa Mg2 +: Ang konsentrasyon sa Mg2 + ion adunay dako nga epekto sa kahusayan sa pagpadako sa PCR.Ang sobra nga konsentrasyon makapakunhod sa kaatbang nga sekso sa PCR amplification.Kung ang konsentrasyon gamay ra, ang PCR amplification output mahimo pa gani nga mapakyas ang PCR amplification nga wala ang expansion band.

Pagbag-o sa gidaghanon sa reaksyon: Ang gidaghanon nga gigamit sa PCR amplification mao ang 20ul, 30ul, ug 50ul o 100uL, ang dako nga gidaghanon sa aplikasyon alang sa PCR amplification gitakda sumala sa lain-laing mga katuyoan sa siyentipikong panukiduki ug clinical testing.Human sa paghimo sa gagmay nga mga volume sama sa 20ul, gikinahanglan ang paghimo sa kondisyon sa pisi sa paghimo sa gidak-on, kung dili kini mapakyas.

Pisikal nga mga rason: Ang pagbag-o importante kaayo alang sa PCR amplification.Kung ang temperatura sa pagkadunot ubos, ang panahon sa pagkadunot mubo, kini lagmit nga mahitabo sa mga bakak nga negatibo;kaayo ubos nga annealing temperatura mahimong hinungdan sa non-specific amplification ug pagpakunhod sa piho nga amplification efficiency.Makaapektar pag-ayo sa kombinasyon sa mga primer ug mga templates aron makunhuran ang kahusayan sa pagpadako sa PCR.Usahay kinahanglan nga gamiton ang standard nga mga thermometer aron mahibal-an ang pagkabag-o, pag-annealing ug pagpalugway sa temperatura sa extension o water-soluble cooker, nga usa sa mga hinungdan sa kapakyasan sa PCR.

Mga variant sa target sequence: Kung mahitabo ang target sequence, usa ka mutation o pagtangtang, ang kombinasyon sa prototype ug template gihiusa, o tungod sa kakulang sa target sequence, ang primer ug ang template mawad-an sa complementary sequence, ug ang PCR amplification niini dili magmalampuson.

● Sayop nga positibo

Ang PCR amplification band makita nga nahiuyon sa target sequence band, ug usahay ang banda niini mas hapsay ug mas taas.

Ang disenyo sa primer dili angay: ang pinili nga pagkasunod-sunod sa pagpadako ug pagkasunod-sunod nga dili katuyoan sa pagpadako adunay homologous, mao nga kung ang pagpadako sa PCR, ang mga produkto nga gipadako sa PCR dili mga pagkasunod-sunod nga wala’y katuyoan.Ang target nga han-ay mubo ra kaayo o ang primer mubo ra kaayo, ug kini daling ma-false positive.Kinahanglang desinyo pag-usab.

Cross pollution sa target sequence o amplification nga mga produkto: Adunay duha ka rason alang niini nga polusyon: Una, cross-pollution sa tibuok genome o dagkong mga bahin, nga mosangpot sa sayop nga mga positibo.Kini nga matang sa sayop nga positibo mahimong masulbad pinaagi sa mosunod nga mga pamaagi: Pag-amping ug malumo sa panahon sa operasyon aron mapugngan ang target nga han-ay gikan sa inhaled ngadto sa sample gun o splash gikan sa centrifugal tube.Gawas sa mga enzyme ug mga sangkap nga dili makasugakod sa taas nga temperatura, ang tanan nga mga reagents o kagamitan kinahanglan nga disimpektahan sa taas nga presyur.Ang centrifugal nga mga tubo ug mga sample kinahanglan gamiton sa usa ka higayon.Kung gikinahanglan, sa dili pa idugang ang mga espesimen, ang reaksyon nga tubo ug reagent maladlad sa ultraviolet rays aron gub-on ang naglungtad nga nucleic acid.Ikaduha, ang gagmay nga mga tipik sa polusyon sa hangin.Kini nga gagmay nga mga tipik mas mubo kaysa target nga han-ay, apan kini adunay piho nga homology.Mahimo kining idugtong sa usag usa.Pagkahuman sa pagpuno sa mga primer, ang produkto sa PCR mahimong mapalapad, nga mahimong hinungdan sa sayup nga positibo nga produksiyon.Mahimo kining gamiton sa pagpakunhod o pagwagtang sa nest PCR method.

● Pagpakita dili piho nga amplification band

Ang mga banda nga mitungha human sa PCR amplification dili uyon sa gipaabot nga gidak-on, o dako o gamay, o sa samang higayon, o sa samang higayon, espesipikong amplification bands ug non-specific amplification bands.Ang pagtunga sa dili piho nga mga banda mao ang: Una, ang mga primer dili kompleto nga komplementaryo sa target nga han-ay, o ang polymerization sa primer aron maporma ang usa ka di cluster.Ang ikaduha mao nga ang konsentrasyon sa MG2+ ions kay taas kaayo, ang annealing temperature ubos ra kaayo, ug ang gidaghanon sa PCR cycles nalangkit.Ikaduha, ang kalidad ug gidaghanon sa mga enzyme.Kasagaran, ang mga enzyme sa pipila nga mga gigikanan dali nga naa sa dili espesyal nga mga banda ug ang mga enzyme sa lain nga gigikanan wala mahitabo.Usahay mahitabo usab ang dili piho nga pagpadako sa mga enzyme.Ang mga kontra mao ang: gidesinyo pag-usab nga madanihon kung gikinahanglan.Bawasan ang gidaghanon sa enzyme o ilisan ang enzyme sa laing tinubdan.Bawasan ang gidaghanon sa nag-una, dugangi ang gidaghanon sa mga template sa hustong paagi, ug pagpakunhod sa gidaghanon sa mga siklo.Tukma nga dugangan ang temperatura sa annealing o gamita ang duha ka paagi sa temperatura nga punto (93°C degeneration, annealing ug extending sa mga 65°C).

● Nagpakita nga flaky tow o smear tape

Ang PCR amplification usahay makita nga gi-apply o kinhason o sama sa karpet nga bakus.Tungod sa hinungdan, tungod sa sobra nga gidaghanon sa mga enzyme o dili maayo nga kalidad sa enzyme, ang konsentrasyon sa dNTP taas kaayo, ang konsentrasyon sa Mg2 + taas kaayo, ang temperatura sa annealing ubos kaayo, ug ang gidaghanon sa mga siklo sobra ra.Ang mga kontra nga lakang mao ang: ①Pakunhod ang gidaghanon sa mga enzyme, o usba ang enzyme sa laing tinubdan.②Pakunhod ang konsentrasyon sa dNTP ③Sakto nga pagpakunhod sa konsentrasyon sa Mg2+.④Pagdugang sa gidaghanon sa mga templates ug pagpakunhod sa gidaghanon sa mga cycle.

May Kalabutan nga mga Produkto

PCR Heroᵀᴹ (Adunay Tina)

◮ Mas taas nga pagkamatinud-anon: 6 ka pilo sa ordinaryo nga Taq enzyme;

◮ Mas paspas nga katulin sa pagpadako

◮ Dugang nga template adaptability

◮ Mas taas nga episyente sa amplification

◮ Ang pagkamatugtanon sa kinaiyahan mas lig-on: gibutang sa 37°C sulod sa usa ka semana, nagmintinar sa labaw sa 90% nga kalihokan;

◮ Kini adunay 5'→3' DNA polymerase activity ug 5'→3' exonuclease activity, walay 3'→5' exonuclease activity.

PCR Easyᵀᴹ (Adunay Tina)

Ang talagsaon nga sistema sa reaksyon ug taas nga episyente nga Taq DNA Polymerase naghimo sa reaksyon sa PCR nga adunay mas taas nga kahusayan sa amplification, espesipiko ug pagkasensitibo.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Usa ka Lakang)-SYBR Green I

◮ Ang one-step kit naghimo ug reverse transcription ug qPCR duha ka reaksyon sa samang tubo, kinahanglan lang nga idugang ang template nga RNA, piho nga PCR primers ug RNase-Free ddH₂O.

◮ Ang kit makadali ug episyente sa quantitatively nga pag-analisar sa viral RNA o pagsubay sa RNA.

◮ Ang kit naggamit ug talagsaon nga Foregene reverse transcription reagent ug Foregene HotStar Taq DNA Polymerase nga gihiusa uban sa usa ka talagsaon nga sistema sa reaksyon aron epektibong mapausbaw ang episyente sa amplification ug espesipiko sa reaksyon.

◮ Ang optimized reaction system naghimo sa reaksyon nga adunay mas taas nga detection sensitivity, mas lig-on nga thermal stability, ug mas maayo nga tolerance.

◮ RT-qPCR Sayon^TM(Usa ka Lakang) -SYBR Green I kit adunay ROX internal reference dye, nga magamit sa pagwagtang sa signal background ug signal errors tali sa mga atabay, nga sayon ​​​​alang sa mga kustomer sa paggamit sa lain-laing mga modelo sa quantitative PCR instruments.

RT Sayon^TMII (Master Premix para sa first-strand cDNA synthesis alang saTinuod nga Oras nga PCR)

-Episyente nga abilidad sa pagtangtang sa gDNA, nga makatangtang sa gDNA sa template sulod sa 2 ka minuto.

-Episyente nga reverse transcription system, nagkinahanglan lamang kini og 15 minutos aron makompleto ang synthesis sa unang strand cDNA.

-Komplex nga mga template: ang mga template nga adunay taas nga GC nga sulud ug komplikado nga sekondaryang istruktura mahimo usab nga balihon nga adunay taas nga kahusayan.

-High-sensitivity reverse transcription system, pg-level templates mahimo usab nga makakuha og taas nga kalidad nga cDNA.

-Ang reverse transcription system adunay taas nga thermal stability, ang kamalaumon nga temperatura sa reaksyon mao ang 42 ℃, ug kini adunay maayo nga reverse transcription performance sa 50 ℃.