Ang PCR (polymerase chain reaction) maoy usa sa in-vitro DNA amplification nga mga teknolohiya, nga adunay kasaysayan nga kapin sa 30 ka tuig.

Ang teknolohiya sa PCR gipasiugdahan ni Kary Mullis sa Cetus, USA niadtong 1983. Nag-aplay si Mullis og PCR patent niadtong 1985 ug gipatik ang unang PCR academic paper sa Science sa samang tuig.Si Mullis gihatagan ug Nobel Prize sa chemistry niadtong 1993 alang sa iyang trabaho.

Pangunang mga Prinsipyo sa PCR

Ang PCR makapadako sa target nga mga tipik sa DNA sa kapin sa usa ka milyon ka beses.Ang prinsipyo kay ubos sa catalysis sa DNA polymerase, gamit ang parent strand DNA isip template ug specific primer isip sugod nga punto sa extension.Gisundog kini sa vitro pinaagi sa mga lakang sama sa denaturation, annealing, ug extension.Ang proseso sa anak nga babaye strand DNA komplementaryo sa ginikanan strand template DNA.

Ang standard nga proseso sa PCR gibahin sa tulo ka mga lakang:

1.Denaturation: Gamita ang taas nga temperatura sa pagbulag sa DNA double strands.Ang hydrogen bond tali sa DNA double strands nabungkag sa taas nga temperatura (93-98 ℃).

2.Annealing: Human mabulag ang double-stranded DNA, ipaubos ang temperatura aron ang primer makagapos sa single-stranded DNA.

3. Extension: Ang DNA polymerase nagsugod sa pag-synthesize sa mga complementary strand ubay sa DNA strands gikan sa mga primer nga gigapos kung ang temperatura gipaubos.Sa dihang makompleto na ang extension, mahuman ang usa ka siklo, ug ang gidaghanon sa mga tipik sa DNA modoble

Ang pagbalos niining tulo ka mga lakang 25-35 ka beses, ang gidaghanon sa mga tipik sa DNA modaghan pag-ayo.

Ang kinaadman sa PCR mao nga ang lainlaing mga primer mahimong gidisenyo alang sa lainlaing target nga mga gene, aron ang mga tipik sa target nga gene mahimong mapadako sa mubo nga panahon.

Sa pagkakaron, ang PCR mahimong bahinon sa tulo ka kategorya, nga mao ang ordinary PCR, fluorescent quantitative PCR ug digital PCR.

Ang unang henerasyon sa ordinaryo nga PCR

Paggamit ug ordinaryo nga instrumento sa pagpadako sa PCR aron mapadako ang target nga gene, ug dayon gamita ang agarose gel electrophoresis aron mahibal-an ang produkto, ang pagtuki sa kwalitatibo lamang ang mahimo.

Ang mga nag-unang disbentaha sa unang henerasyon nga PCR:

1. Prone sa dili piho nga pagpadako ug bakak nga positibo nga mga resulta.

2.Ang pag-ila nagkinahanglan og taas nga panahon ug ang operasyon lisud.

3. Ang qualitative test ra ang mahimo

Ikaduha nga henerasyon nga Real-Time PCR

Ang Real-Time nga PCR, nailhan usab nga qPCR, naggamit ug fluorescent probes nga mahimong magpakita sa pag-uswag sa sistema sa reaksyon, ug gimonitor ang akumulasyon sa gipakusog nga mga produkto pinaagi sa pagtipon sa mga fluorescent signal, ug gihukman ang mga resulta pinaagi sa fluorescence curve.Kini ma-quantified sa tabang sa Cq value ug standard curve.

Tungod kay ang teknolohiya sa qPCR gihimo sa usa ka sirado nga sistema, ang kalagmitan sa kontaminasyon mikunhod, ug ang fluorescence signal mahimong ma-monitor alang sa quantitative detection, mao nga kini ang labing kaylap nga gigamit sa clinical practice ug nahimong dominanteng teknolohiya sa PCR.

Ang mga fluorescent substance nga gigamit sa real-time nga fluorescent quantitative PCR mahimong bahinon ngadto sa: TaqMan fluorescent probe, molecular beacon ug fluorescent dye.

1) TaqMan fluorescent probe:

Atol sa pagpadako sa PCR, usa ka piho nga fluorescent probe ang idugang samtang nagdugang usa ka pares nga primer.Ang probe usa ka oligonucleotide, ug ang duha ka tumoy gimarkahan sa usa ka reporter nga fluorescent nga grupo ug usa ka quencher fluorescent nga grupo.

Sa diha nga ang probe mao ang intact, ang fluorescent signal nga gipagawas sa reporter grupo masuhop sa quenching grupo;sa panahon sa PCR amplification, ang 5′-3′ exonuclease nga kalihokan sa Taq enzyme nagbuak ug nagpaubos sa probe, nga naghimo sa reporter nga fluorescent nga grupo ug quencher Ang fluorescent nga grupo gibulag, aron ang fluorescence monitoring system makadawat sa fluorescence signal, nga mao, sa matag higayon nga ang DNA strand gipadako, usa ka fluorescent nga pagporma sa fluorescent nga molekula ang bug-os nga naporma, usa ka fluorescent nga pagporma sa fluorescent nga molekula. ang produkto sa PCR.

2) SYBR fluorescent tina:

Sa sistema sa reaksyon sa PCR, ang sobra sa SYBR fluorescent dye gidugang.Human ang SYBR fluorescent dye dili espesipikong gilakip sa DNA double-strand, kini nagpagawas ug fluorescent signal.Ang molekula sa tina nga SYBR nga wala gilakip sa kadena dili magpagawas sa bisan unsang fluorescent signal, sa ingon masiguro ang fluorescent signal Ang pagtaas sa mga produkto sa PCR hingpit nga na-synchronize sa pagtaas sa mga produkto sa PCR.Ang SYBR mogapos lang sa double-stranded nga DNA, mao nga magamit ang melting curve aron mahibal-an kung espesipiko ba ang reaksyon sa PCR.

3) Molecular beacon:

Kini usa ka stem-loop nga doble-label nga oligonucleotide nga probe nga nagporma sa usa ka hairpin structure nga mga 8 ka base sa 5 ug 3 ka tumoy.Ang mga han-ay sa nucleic acid sa duha ka tumoy kay komplementaryong gipares, hinungdan nga ang fluorescent nga grupo ug ang quenching nga grupo hugot.Duol, walay fluorescence nga mabuhat.

Human mamugna ang produkto sa PCR, atol sa proseso sa pag-annealing, ang tunga-tunga nga bahin sa molekular nga beacon gipares sa usa ka espesipikong pagkasunod-sunod sa DNA, ug ang fluorescent nga gene gibulag gikan sa quencher gene aron makahimo og fluorescence.

Ang mga nag-unang disbentaha sa ikaduhang henerasyon nga PCR:

Kulang pa ang pagkasensitibo, ug dili tukma ang pagkakita sa ubos nga kopya nga mga espesimen.

Adunay impluwensya sa bili sa background, ug ang resulta dali nga maapektuhan.

Kung adunay mga PCR inhibitor sa sistema sa reaksyon, ang mga resulta sa pag-ila dali nga mabalda.

Ikatulong henerasyon nga digital PCR

Ang Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) nagkalkula sa numero sa kopya sa target nga han-ay pinaagi sa end-point detection, ug makahimo sa tukma nga hingpit nga quantitative detection nga walay paggamit sa internal nga mga kontrol ug standard curves.

Ang digital PCR naggamit sa end-point detection ug wala magdepende sa Ct value (cycle threshold), mao nga ang digital PCR reaction dili kaayo maapektuhan sa amplification efficiency, ug ang tolerance sa PCR reaction inhibitors gipauswag, nga adunay taas nga katukma ug reproducibility.

Tungod sa mga kinaiya sa taas nga pagkasensitibo ug taas nga katukma, dili kini dali nga mabalda sa mga inhibitor sa reaksyon sa PCR, ug mahimo’g makab-ot ang tinuud nga hingpit nga pag-ihap nga wala’y sukaranan nga mga produkto, nga nahimo’g usa ka panukiduki ug aplikasyon nga hotspot.

Sumala sa lain-laing mga porma sa reaksyon unit, kini mahimong bahinon ngadto sa tulo ka nag-unang matang: microfluidic, chip ug droplet sistema.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Base sa microfluidic nga teknolohiya, ang DNA template gibulag.Ang microfluidic nga teknolohiya makaamgo sa sample nano-upgrade o ang kaliwatan sa gagmay nga mga tinulo, apan ang mga tinulo nagkinahanglan sa usa ka espesyal nga adsorption pamaagi ug unya inubanan sa PCR reaksyon sistema.Ang mdPCR anam-anam nga gisagop sa ubang mga paagi sa pag-ilis.

2) Droplet-based digital PCR, ddPCR:

Gamita ang water-in-oil droplet generation technology aron maproseso ang sample ngadto sa droplets, ug bahina ang reaction system nga adunay nucleic acid molecules ngadto sa liboan ka nanoscale droplets, nga ang matag usa walay sulod sa nucleic acid target molecule nga mamatikdan, o Naglangkob sa usa ngadto sa pipila ka nucleic acid target molekula nga sulayan.

3) Chip-based digital PCR, cdPCR:

Gamita ang integrated fluid pathway nga teknolohiya sa pagkulit sa daghang microtubes ug microcavities sa silicon wafers o quartz glass, ug kontrola ang dagan sa solusyon pinaagi sa lain-laing control valves, ug bahinon ang sample liquid ngadto sa nanometer nga parehas ang gidak-on ngadto sa reaction wells para sa digital PCR Reaction aron makab-ot ang hingpit nga quantification.

Ang mga nag-unang disbentaha sa ikatulo nga henerasyon nga PCR:

Ang mga kagamitan ug mga reagents mahal.

Taas ang mga kinahanglanon sa kalidad sa template.Kung ang gidaghanon sa template molapas sa gidaghanon sa microsystem, imposible ang pag-ihap, ug kung kini gamay ra, ang katukma sa quantification makunhuran.

Ang mga bakak nga positibo mahimo usab nga mamugna kung adunay dili piho nga pagpadako.