Ang COVID-19 usa ka makatakod nga sakit nga gipahinabo sa Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2. Kung ang usa ka tawo nataptan, ang kasagaran nga mga simtomas naglakip sa hilanat, ubo, ug pagkulang sa gininhawa.

Ang mga sample nga gigamit sa pagsulay mahimong kolektahon pinaagi sa nasopharyngeal swabs o oropharyngeal swabs.

Unsa ang PCR?

Ang standard nga pamaagi sa pagtuki sa coronavirus mao ang polymerase chain reaction, PCR.Kini usa ka pamaagi nga kaylap nga gigamit sa biology sa molekula.Makakopya dayon kinig minilyon ngadto sa binilyon nga espesipikong mga tipik sa DNA.

Ang bag-ong coronavirus adunay usa ka taas kaayo nga single-stranded RNA genome.Aron mahibal-an kini nga mga virus pinaagi sa PCR, ang mga molekula sa RNA kinahanglan nga mabag-o sa ilang mga komplementaryong pagkasunod-sunod sa DNA pinaagi sa reverse transcriptase, ug dayon ang bag-ong na-synthesize nga DNA mahimong mapadako pinaagi sa standard nga mga pamaagi sa PCR, nga kasagarang nailhan nga RT-PCR.

Proseso sa RT-PCR

Pagkuha sa RNA

Aron mahimo kini nga pamaagi, kinahanglan nga makuha ang viral RNA.Ang lainlaing mga RNA purification kits mahimong magamit alang sa dali, paspas ug epektibo nga pagbulag.

Aron makuha ang viral RNA gamit ang commercial kit, idugang una ang sample sa microcentrifuge tube ug dayon isagol kini sa lysis buffer.Kini nga buffer kay na-denatured kaayo ug kasagaran naglangkob sa phenol ug guanidine isothiocyanate.Dugang pa, ang mga inhibitor sa RNase kasagarang anaa sa buffer sa lysis aron maseguro ang pagkahimulag sa intact viral RNA.

Human sa pagdugang sa lysis buffer, vortex ang mixing tube pinaagi sa pulso ug incubate sa lawak temperatura.Ang virus unya lysed ubos sa kaayo denaturing kondisyon nga gihatag sa lysis buffer.

Human ma-lysed ang sample, usa ka centrifuge tube ang gigamit alang sa pamaagi sa pagputli.Ang sample gikarga sa centrifuge tube ug dayon centrifuge.

Kini nga pamaagi mao ang usa ka solid phase extraction nga pamaagi diin ang stationary phase naglangkob sa usa ka silica gel matrix.

Ubos sa labing maayo nga mga kondisyon sa asin ug pH, ang mga molekula sa RNA nagbugkos sa silica membrane.

Sa samang higayon, ang protina ug uban pang mga kontaminante gikuha.

Human sa centrifugation, ibutang ang centrifuge tube ngadto sa usa ka limpyo nga collection tube, ilabay ang filtrate, ug dayon idugang ang washing buffer.

Ibutang pag-usab ang tubo sa centrifuge aron mapugos ang paghugas sa buffer pinaagi sa lamad.Kini magwagtang sa tanang nahibiling mga hugaw gikan sa lamad, magbilin lamang sa RNA nga gigapos sa silica gel.

Human mahugasan ang sample, ibutang ang tubo sa limpyo nga microcentrifuge tube ug idugang ang elution buffer.

Dayon kini gi-centrifuged aron mapugos ang elution buffer pinaagi sa lamad.Ang elution buffer nagtangtang sa viral RNA gikan sa spin column ug makakuha og purified RNA nga walay mga protina, inhibitor, ug uban pang mga kontaminante.

LAKANG 2

Gisagol nga concentrate

Human makuha ang viral RNA, ang sunod nga lakang mao ang pag-andam sa reaction mixture alang sa PCR amplification.Niini nga lakang, gigamit ang konsentrasyon.Kini nga konsentrado nga solusyon kay usa ka premixed concentrated solution nga gilangkuban sa premix, reverse transcriptase, nucleotides, forward primer, reverse primer, TaqMan probe ug DNA polymerase.

Sa katapusan, aron makompleto kini nga sagol nga reaksyon, idugang ang template sa RNA.Ang mga tubo gisagol sa pulse vortexing, ug dayon ang reaksyon nga timpla gikarga sa PCR plate.Ang PCR plate kasagarang adunay 96 ka atabay ug maka-analisar ug daghang sample sa samang higayon.

LAKANG 3

Pagpadako sa PCR

Sunod, ibutang ang plato sa PCR machine, nga usa ka thermal cycler.

Ang real-time nga RT-PCR gigamit sa pag-detect sa 2019 novel coronavirus pinaagi sa pagpadako sa target sequence sa RdrRP gene, E gene ug N gene.Ang pagpili sa target nga gene nagdepende sa primer ug probe sequence.

Ang unang lakang sa RT-PCR mao ang reverse transcription.Ang unang strand sa complementary DNA gi-synthesize, nga gisugdan sa PCR reverse primer, nga nagbugkos sa komplementaryong bahin sa viral RNA genome.Dayon ang reverse transcriptase magdugang sa DNA nucleotides sa 3′end sa primer aron ma-synthesize ang DNA nga komplementaryo sa viral RNA.Ang temperatura ug gidugayon niini nga lakang nagdepende sa mga primer, target nga RNA, ug reverse transcriptase nga gigamit.

Sunod, usa ka inisyal nga lakang sa denaturation ang gipadapat, nga moresulta sa denaturation sa RNA-DNA hybrid.Kini nga lakang gikinahanglan aron ma-activate ang DNA polymerase.Sa parehas nga oras, ang reverse transcriptase dili aktibo.

Ang PCR naglangkob sa usa ka serye sa mga thermal cycle.Ang matag cycle naglangkob sa denaturation, annealing ug extension nga mga lakang.

Ang lakang sa denaturation naglakip sa pagpainit sa reaction chamber ngadto sa 95 degrees Celsius ug paggamit niini alang sa denaturation sa double-stranded DNA template.

Sa sunod nga lakang, ang temperatura sa reaksyon gipakunhod ngadto sa 58 degrees Celsius, nga nagtugot sa forward primer nga mag-anneal sa komplementaryong bahin sa iyang single-stranded DNA template.Ang temperatura sa annealing direkta nagdepende sa gitas-on ug komposisyon sa primer.

Sa lakang sa extension, ang DNA polymerase nag-synthesize sa bag-ong DNA strand nga komplementaryo sa DNA template strand.Pinaagi sa pagdugang sa libre nga nuclei nga komplementaryo sa template sa 5′to 3′direksyon gikan sa reaction mixture.Ang temperatura niini nga lakang nagdepende sa DNA polymerase nga gigamit.

Human sa unang siklo, usa ka double-stranded nga target sa DNA ang makuha.

Dayon, pagsulod sa ikaduhang siklo.Ang double-stranded nga DNA gi-denatured aron makahimo og duha ka single-stranded nga molekula sa DNA.

Sa sunod nga lakang, ang temperatura sa reaksyon gipaubos, ang mga primer gi-annealed sa matag single-stranded DNA template, ug ang Taq-man probe gi-annealed sa komplementaryong bahin sa target nga DNA.

Ang TaqMan probe naglangkob sa usa ka fluorophore covalently nalambigit sa 5′katapusan sa oligonucleotide probe.Sa diha nga naghinam-hinam sa kahayag nga tinubdan sa cycler, ang fluorophore nagpagawas sa fluorescence.Dugang pa, ang probe gilangkuban sa usa ka quencher sa 3′end.Ang kaduol sa reporter gene sa quencher nagpugong sa pag-ila sa fluorescence.

Sa lakang sa extension, ang DNA polymerase nag-synthesize og bag-ong strand.Sa dihang ang polymerase makaabot sa TaqMan probe, ang endogenous 5′nuclease nga kalihokan niini moputol sa probe, nga magbulag sa tina gikan sa quencher.

Sa matag siklo sa PCR, daghang mga molekula sa tina ang gipagawas, nga nagresulta sa pagtaas sa intensity sa fluorescence nga katumbas sa gidaghanon sa mga amplicon nga gi-synthesize.

Kini nga pamaagi nagtugot sa pagbanabana sa gidaghanon sa gihatag nga han-ay nga anaa sa sample.Ang gidaghanon sa double-stranded nga mga tipik sa DNA nagdoble sa matag siklo.Busa, ang PCR mahimong magamit sa pag-analisar sa gagmay kaayo nga mga sampol.

Para sa pagsukod sa fluorescent signal, tungsten halogen lamp, excitation filter, reflector, lens, emission filter ug charge coupled device-gamit ang CCD camera.

LAKANG 4 Hibal-i

Para sa pagsukod sa fluorescent signal, tungsten halogen lamp, excitation filter, reflector, lens, emission filter ug charge coupled device-gamit ang CCD camera.

Ang sinala nga kahayag gikan sa lampara makita sa reflector, moagi sa condenser lens, ug gipunting ngadto sa sentro sa matag lungag.Dayon ang fluorescence nga gipagawas gikan sa lungag makita gikan sa salamin, moagi sa emission filter, ug makita sa CCD camera.Sa matag siklo sa PCR, ang naghinam-hinam sa kaugalingon nga fluorophore nga suga mahimong makit-an sa CCD.

Gi-convert niini ang nakuha nga kahayag ngadto sa digital data.Kini nga pamaagi gitawag nga real-time nga PCR, ug kini nagtugot sa real-time nga pag-monitor sa pag-uswag sa reaksyon sa PCR.