Ang tanan naghisgot bahin sa prinsipyo sa qRT-PCR nga eksperimento, primerong disenyo, resulta sa interpretasyon, ug uban pa, apan sa akong hunahuna kinahanglan nakong ipaambit kanimo ang eksperimento nga operasyon sa qRT-PCR.Kini gamay, apan kini mahitungod sa mga resulta.
Sa dili pa buhaton ang qRT-PCR, kinahanglan nga adunay klaro nga pagsabut sa among kaugalingon nga RNA ug mga pamaagi sa operasyon.Human sa tanan, ang atong mga paningkamot gitumong sa pagkuha sa mga resulta, kay sa pagpraktis lamang.Mao nga sa dili pa buhaton ang qRT-PCR, kinahanglan naton mahibal-an ang mga musunud nga isyu (ang pipila niini magamit ra sa SYBR).
1 Sigurado ka ba nga ang imong RNA dili madaot?
Ang NanoDrop 2000 makamatikod lamang sa konsentrasyon ug kaputli sa RNA, apan dili makamatikod sa integridad sa RNA.
Ang RNA (RNA Intesity Number) nga kantidad mahimong magpakita sa integridad sa RNA, nga nakit-an sa Agilent 2100 Bioanalyzer system.
Fig. Schematic diagram sa RIN values para sa lain-laing RNA samples (eukaryotes)
Bisan pa, ang mga laboratoryo sa kasagaran walay Agilent 2100 Bioanalyzer.Sa kini nga kaso, kita makamatikod pinaagi sa formaldehyde gel, apan ang gikinahanglan alang sa kinatibuk-ang kantidad sa RNA mao ang hataas nga, mao nga ang labing paspas nga paagi mao ang paggamit sa ordinaryo nga gel electrophoresis.Gikinahanglan nga naa sa usa ka palibot nga wala’y nuclease, busa kinahanglan nga hugasan ang tangke sa electrophoresis, botelya sa sol, bracket sa gel ug suklay sa tubig sa DEPC.Ang agarose kay nuclease-free usab (basta bag-o pa lang kining giablihan), ug ang Loading Buffer kinahanglang bag-o lang nga ablihan kutob sa mahimo, nga adunay 1.2% nga gel.
Timan-i nga ang gel kinahanglan nga hingpit nga matunaw, kung dili kini hinungdan sa dili managsama nga mga banda, ingon sa gipakita sa sample 9 sa numero.Kung ang boltahe taas kaayo o nagdagan sa dugay nga panahon makamugna og kainit ug hinungdan sa pagkadaot sa RNA, busa ang boltahe ug oras kinahanglan nga kontrolon nga makatarunganon.Dugang pa, ang pagdagan sa gel mahimo usab nga labi nga mahibal-an kung adunay nahabilin nga DNA sa sample, ug pag-obserbar kung adunay daghang gidaghanon sa gipabilin nga mga banda sa atabay sa pag-apod-apod.
Hulagway.Gel electrophoresis detection sa RNA
2 Sigurado ka ba bahin sa konsentrasyon sa imong cDNA?
Ang kasinatian sa dagkong mga igsoon sa laboratoryo mao nga ang cDNA sa 20 ul nga sistema nga nakuha sa matag inversion direkta nga lasaw 20X, samtang ang post-doctoral nga mga babaye lasaw 10X.Kasagaran nagdepende ko sa sitwasyon.Tungod kay ang kalidad sa RNA nga gihisgutan sa matag tawo lahi, ang lebel sa pagbalit-ad lahi usab, ug ang pagbag-o nga teknolohiya mahimong dili lig-on.
Mao nga sa matag higayon nga makuha nako ang gibalikbalik nga cDNA, una nako nga lasaw kini mga 3 ka beses, ug dayon gamiton ang gene sa housekeeping aron buhaton ang RT-PCR, ang gidaghanon sa mga siklo sa kasagaran 25 nga mga siklo, aron mahibal-an ang piho nga konsentrasyon, ug dayon mahibal-an ang katapusan nga hinungdan sa pagtunaw.
3 Sigurado ka ba nga dali gamiton ang imong mga primer?
Makapasar kini sa melting curve sa qRT-PCR, pero gasto gihapon ni.Para sa mga laboratoryo nga walay daghang salapi, kung makakuha sila og daghang mga primer, magamit nila ang ordinaryo nga RT-PCR aron makita kung kini usa ka banda ug mahibal-an ang espesipiko sa mga primer.Kung ang laboratoryo dili kulang sa salapi, ang espesipiko sa tanan nga mga primer mahimong mailhan kausa pinaagi sa curve sa pagtunaw.
4 Sigurado ka ba nga ang imong mga kahimtang sa eksperimento haom?
Ang SYBR kinahanglang protektahan gikan sa kusog nga kahayag, busa sulayi nga palonga ang overhead nga suga kon magdugang og SYBR reagent, ug kinahanglan lang nga mogamit og dim light aron makompleto kini.
Tipigi ang SYBR sa 4°C.Kung gigamit, hinayhinay nga balit-aron pataas ug paubos aron maayo ang pagsagol aron malikayan ang pagbula, ug ayaw pag-vortex nga kusog.
Ang ubang mga manghod nga babaye ganahang magdrowing og marka sa PCR board tungod sa kahadlok nga masagol ang mga sample, nga sayop.Tungod kay ang imong mga marker lagmit nga makaapekto sa pagkolekta sa mga fluorescent signal, kasagaran akong girekomendar ang mga junior nga mogamit sa mga eksperimentong notebook aron makatabang sa memorya, sama sa gipakita sa ubos.
Hulagway.qRT-PCR sample loading diagram
5 Sigurado ka nga husto ang imong gibuhat?
Siguruha nga magsul-ob og gwantis, magsul-ob og gwantis, magsul-ob og gwantis, ug isulti ang importante nga mga butang tulo ka beses.
Aron makunhuran ang pagkaladlad sa SYBR sa kahayag, gusto nako nga magdugang una og template, sama sa gipakita sa hulagway sa ubos.Sumala sa kasinatian, ang pagdugang sa usa ka gamay nga kantidad sa template lagmit nga hinungdan sa mga sayup sa sampling.Busa, aron mamenosan ang sayop nga gipahinabo sa pagdugang og gamay nga template, kasagaran akong doblehon pag-usab ang sample, ug doblehon ang kantidad kon idugang ang sample aron makunhuran ang gidaghanon sa H2O2 nga idugang.
Hulagway.Schematic diagram sa qRT-PCR loading
Dayon i-configure ang qRT-PCR nga sistema sama sa mosunod.
Hulagway.qRT-PCR system preparation diagram
PAHINUMDOM: Ang proseso sa pag-configure kinahanglan nga buhaton sa yelo.
Human sa pagdugang sa sample, idikit ang transparent sealing film.Sulayi nga dili hikapon ang nawong sa transparent nga sealing film gamit ang imong mga kamot, pag-operate lang gikan sa wanang sa duha ka kilid sa pelikula.Tungod kay ang mga fingerprint mahimo usab nga makaapekto sa pagkolekta sa mga fluorescent signal.Dayon gamita ang usa ka centrifuge aron paspas nga mag-centrifuge sulod sa 10 ka s sa ubos nga tulin aron mapugngan ang sample gikan sa pagbitay sa bungbong.
May Kalabutan nga mga Produkto:
Oras sa pag-post: Abr-28-2023
