Ang RT-qPCR gihimo gikan sa ordinaryo nga teknolohiya sa PCR.Nagdugang kini og fluorescent nga mga kemikal (fluorescent dyes o fluorescent probes) sa tradisyonal nga PCR reaction system, ug nakamatikod sa PCR annealing ug extension nga proseso sa tinuod nga panahon sumala sa ilang lain-laing mga mekanismo sa luminescent.Ang mga pagbag-o sa fluorescent signal sa medium gigamit aron makalkulo ang kantidad sa pagbag-o sa produkto sa matag siklo sa PCR.Sa pagkakaron, ang labing komon nga mga pamaagi mao ang fluorescent dye method ug probe method.

Fluorescent nga tina nga pamaagi:
Ang ubang mga fluorescent dyes, sama sa SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ug uban pa, dili mobuga ug kahayag sa ilang kaugalingon, apan mopagawas sa fluorescence human mabugkos sa menor de edad nga groove sa dsDNA.Busa, sa sinugdanan sa reaksyon sa PCR, ang makina dili makamatikod sa fluorescent signal.Sa diha nga ang reaksyon nagpadayon sa annealing-extension (two-step method) o extension stage (three-step method), ang double strands giablihan niining panahona, ug ang bag-ong DNA polymerase Atol sa strand synthesis, ang fluorescent molecules gihiusa sa dsDNA minor groove ug nagpagawas sa fluorescence.Samtang nagkadaghan ang mga siklo sa PCR, nagkadaghan ang mga tina nga naghiusa sa dsDNA, ug ang signal sa fluorescent padayon usab nga gipauswag.Dad-a ang SYBR Green Ⅰ isip pananglitan.
Pamaagi sa pagsusi:
Ang Taqman probe mao ang labing kasagarang gigamit nga hydrolysis probe.Adunay usa ka fluorescent nga grupo sa 5′ nga katapusan sa probe, kasagaran FAM.Ang probe mismo usa ka han-ay nga komplementaryo sa target nga gene.Adunay usa ka fluorescent quenching nga grupo sa 3′ nga tumoy sa fluorophore.Sumala sa prinsipyo sa fluorescence resonance energy transfer (Förster resonance energy transfer, FRET), sa dihang ang reporter fluorescent group (donor fluorescent molecule) ug ang quenching fluorescent group (acceptor fluorescent molecule) Sa diha nga ang excitation spectrum nagsapaw ug ang gilay-on duol kaayo (7-10nm), ang excitation sa huyang nga fluorescent molekula mao ang modawat sa fluorescent molecule. gisugdan.Busa, sa sinugdanan sa reaksyon sa PCR, kung ang pagsusi libre ug wala'y sulod sa sistema, ang tigbalita nga fluorescent nga grupo dili mopagawas sa fluorescence.Kung mag-annealing, ang primer ug probe magbugkos sa template.Atol sa yugto sa extension, ang polymerase padayon nga nag-synthesize sa bag-ong mga kadena.Ang DNA polymerase adunay 5′-3′ exonuclease nga kalihokan.Sa pag-abot sa probe, ang DNA polymerase mag-hydrolyze sa probe gikan sa template, ibulag ang reporter fluorescent group gikan sa quencher fluorescent group, ug buhian ang fluorescent signal.Tungod kay adunay usa-sa-usa nga relasyon tali sa probe ug sa template, ang pamaagi sa pagsusi mas labaw sa pamaagi sa tina sa mga termino sa katukma ug pagkasensitibo sa pagsulay.

Fig 1 Prinsipyo sa qRT-PCR

Panguna nga disenyo
Mga baruganan:

Ang mga primer kinahanglan nga gidisenyo sa gitipigan nga rehiyon sa serye sa nucleic acid ug adunay espesipiko.

Labing maayo nga gamiton ang cDNA sequence, ug ang mRNA sequence madawat usab.Kung dili, susiha ang cds region design sa DNA sequence.
Ang gitas-on sa fluorescent quantitative nga produkto mao ang 80-150bp, ang pinakataas mao ang 300bp, ang primer nga gitas-on kasagaran tali sa 17-25 nga mga base, ug ang kalainan tali sa upstream ug downstream primers kinahanglan dili kaayo dako.

Ang sulud sa G+C naa sa taliwala sa 40% ug 60%, ug ang 45-55% ang labing kaayo.
Ang bili sa TM kay tali sa 58-62 degrees.
Sulayi nga likayan ang mga primer dimer ug self-dimer, (dili makita nga labaw sa 4 ka parisan sa sunod-sunod nga complementary base) hairpin structure, kung dili malikayan, himoa ang ΔG<4.5kJ/mol* Kung dili nimo masiguro nga ang gDNA gikuha sa panahon sa reverse transcription Limpyo, labing maayo nga magdesinyo sa mga primer sa intron *3′ nga estraktura aron malikayan ang AT, 3′ nga dato, ug dili mabag-o ang dato nga istruktura sa AT, GC2, ug GC2. ) mga primer ug dili
espesipiko Ang homology sa heterogeneously amplified sequence mas maayo nga ubos sa 70% o adunay 8 ka komplementaryong base homology.
Database:
CottonFGD pagpangita pinaagi sa mga keyword
Panguna nga disenyo:
IDT-qPCR primer nga disenyo

Fig2 IDT online primer design tool page

Pagpakita sa panid sa resulta sa Fig3
Disenyo sa lncRNA primers:
lncRNA:parehas nga mga lakang sama sa mRNA.
miRNA:Ang prinsipyo sa pamaagi sa stem-loop: Tungod kay ang tanang miRNA mugbo nga mga han-ay sa mga 23 nt, ang direkta nga PCR detection dili mahimo, mao nga ang stem-loop sequence tool gigamit.Ang pagkasunod-sunod sa stem-loop usa ka single-stranded nga DNA nga mga 50 nt, nga makahimo sa usa ka hairpin structure sa iyang kaugalingon.3 'Ang katapusan mahimong gidisenyo isip usa ka han-ay nga komplementaryo sa miRNA partial fragment, unya ang target nga miRNA mahimong konektado sa stem-loop sequence atol sa reverse transcription, ug ang kinatibuk-ang gitas-on mahimong moabot sa 70bp, nga nahisubay sa gitas-on sa gipadako nga produkto nga gitino sa qPCR.Tailing miRNA primer nga disenyo.
Pagsusi nga piho sa amplification:
Online nga blast database: CottonFGD blast pinaagi sa pagkaparehas sa han-ay
Lokal nga pagbuto: Pag-refer sa paggamit sa Blast + aron mahimo ang lokal nga pagbuto, ang linux ug macos mahimong direkta nga magtukod usa ka lokal nga database, mahimo usab ang sistema sa win10 pagkahuman ma-install ang ubuntu bash.Paghimo sa database sa lokal nga pagbuto ug lokal nga pagbuto;ablihi ang ubuntu bash sa win10.
Matikdi: Ang upland cotton ug sea island cotton kay tetraploid crops, mao nga ang resulta sa blast sagad duha o daghan pa nga posporo.Kaniadto, ang paggamit sa NAU cds ingon usa ka database sa paghimo sa pagbuto lagmit nga makit-an ang duha ka homologous nga mga gene nga adunay pipila ra nga mga kalainan sa SNP.Kasagaran, ang duha ka homologous nga mga gene dili mabulag pinaagi sa primer nga disenyo, mao nga sila gitratar nga parehas.Kung adunay usa ka dayag nga indel, ang primer kasagarang gidisenyo sa indel, apan kini mahimong mosangpot sa ikaduha nga istruktura sa primer Ang libre nga enerhiya mahimong mas taas, nga mosangpot sa pagkunhod sa pagkaayo sa amplification, apan kini dili malikayan.

Detection sa primer secondary structure:
Mga lakang:open oligo 7 → input template sequence → close sub-window → save → pangitaa ang primer sa template, pindota ang ctrl+D aron itakda ang primer nga gitas-on → analisa ang nagkalain-laing secondary structures, sama sa self-dimerization body, heterodimer, hairpin, mismatch, ug uban pa.Ang resulta sa atubangan nga primer maayo, walay klaro nga dimer ug hairpin nga estraktura, walay padayon nga komplementaryong mga base, ug ang hingpit nga bili sa libre nga enerhiya ubos pa sa 4.5, samtang ang likod nga primer nagpakita sa padayon Ang 6 nga mga base kay komplementaryo, ug ang libre nga enerhiya mao ang 8.8;Dugang pa, usa ka mas seryoso nga dimer makita sa 3′ katapusan, ug usa ka dimer sa 4 sunod-sunod nga mga base makita.Bisan kung ang libre nga enerhiya dili taas, ang 3′ dimer Chl mahimong seryoso nga makaapekto sa espesipiko sa amplification ug kahusayan sa amplification.Dugang pa, kinahanglan nga susihon kung adunay mga hairpins, heterodimer, ug mga mismatches.

Fig3 oligo7 nga mga resulta sa pagkakita
Pagsusi sa kahusayan sa amplification:
Ang kaepektibo sa pagpadako sa reaksyon sa PCR grabe nga nakaapekto sa mga resulta sa PCR.Usab sa qRT-PCR, ang pagkaayo sa pagpadako labi ka hinungdanon alang sa mga resulta sa quantitative.Kuhaa ang ubang mga substansiya, makina ug protocol sa reaction buffer.Ang kalidad sa mga primera usab adunay dako nga impluwensya sa pagkaayo sa amplification sa qRT-PCR.Aron masiguro ang katukma sa mga resulta, ang relatibong fluorescence quantification ug ang absolute fluorescence quantification kinahanglan nga makamatikod sa amplification efficiency sa mga primer.Giila nga Ang epektibo nga qRT-PCR amplification efficiency anaa sa taliwala sa 85% ug 115%.Adunay duha ka pamaagi:
1. Standard nga pamaagi sa kurba:
a.Pagsagol sa cDNA
b.Gradient dilution
c.qPCR
d.Linear regression equation aron makalkulo ang kaepektibo sa amplification
2. LinRegPCR
Ang LinRegPCR usa ka programa alang sa pagtuki sa tinuod nga oras nga RT-PCR Data, gitawag usab nga quantitative PCR (qPCR) nga datos base sa SYBR Green o susamang chemistry.Ang programa naggamit sa non-baseline corrected data, naghimo ug baseline correction sa matag sample nga Gilain, nagtino sa usa ka window-of-linearity ug dayon naggamit sa linear regression analysis aron mohaum sa usa ka tul-id nga linya pinaagi sa PCR data set.Gikan sa bakilid niini nga linya kalkulado ang kahusayan sa PCR sa matag indibidwal nga sample.Ang mean PCR efficiency kada amplicon ug ang Ct value kada sample gigamit sa pagkwenta sa pagsugod nga konsentrasyon kada sample, nga gipahayag sa arbitraryong fluorescence units.Ang data input ug output kay pinaagi sa Excel spreadsheet.Sample lang
gikinahanglan ang pagsagol, walay gradient
mga lakang gikinahanglan:(Kuhaa ang Bole CFX96 isip pananglitan, dili kaayo Machine nga adunay klaro nga ABI)
eksperimento:kini usa ka sumbanan nga eksperimento sa qPCR.
qPCR data output:Ang LinRegPCR makaila sa duha ka porma sa output files: RDML o quantification Amplification result.Sa tinuud, kini ang tinuud nga oras sa pag-ila sa kantidad sa numero sa siklo ug signal sa fluorescence sa makina, ug ang pagpadako nakuha pinaagi sa pag-analisar sa kantidad sa pagbag-o sa fluorescence sa linear segment efficiency.
Pagpili sa datos: Sa teorya, ang bili sa RDML kinahanglan nga magamit.Gibanabana nga ang problema sa akong kompyuter mao nga ang software dili makaila sa RDML, mao nga ako adunay excel output value isip orihinal nga datos.Kini girekomendar sa paghimo sa usa ka bagis nga screening sa mga data una, sama sa kapakyasan sa pagdugang sa sample, ug uban pa Ang mga punto mahimong mapapas sa output data (siyempre, dili nimo kini mapapas, LinRegPCR dili magtagad niini nga mga punto sa ulahi nga yugto)

Fig5 qPCR data export

Fig6 pagpili sa mga sample nga kandidato

Data input:Open qualification amplification results.xls, → open LinRegPCR → file → basaha gikan sa excel → pilia ang mga parameter sama sa gipakita sa Figure 7 → OK → i-klik ang pagtino sa baselines

Fig7 nga mga lakang sa linRegPCR data input

Resulta:Kung walay pagsubli, walay paggrupo ang gikinahanglan.Kung adunay pagbalik-balik, ang paggrupo mahimong i-edit sa sample nga grupo, ug ang ngalan sa gene gisulod sa identifier, ug dayon ang parehas nga gene awtomatikong ma-grupo.Sa katapusan, i-klik ang file, i-export ang excel, ug tan-awa ang mga resulta.Ang amplification efficiency ug R2 nga mga resulta sa matag atabay ipakita.Ikaduha, kung magbahin ka sa mga grupo, ang gitul-id nga average nga kahusayan sa amplification ipakita.Siguroha nga ang amplification efficiency sa matag primer kay tali sa 85% ug 115%.Kung kini dako kaayo o gamay ra kaayo, kini nagpasabut nga ang pagkaayo sa amplification sa primer dili maayo.

Fig 8 Resulta ug data output

Eksperimental nga proseso:
Mga kinahanglanon sa kalidad sa RNA:
Kaputli:1.7Ang 2.0 nagpakita nga mahimong adunay nahabilin nga isothiocyanate.Ang limpyo nga nucleic acid A260/A230 kinahanglan nga mga 2 . Kung adunay kusog nga pagsuyup sa 230 nm, kini nagpakita nga adunay mga organikong compound sama sa phenate ions.Dugang pa, kini makita sa 1.5% agarose gel electrophoresis.Itudlo ang marker, tungod kay ang ssRNA walay denaturation ug ang molecular weight logarithm walay linear nga relasyon, ug ang molekular nga gibug-aton dili mapahayag sa husto.Konsentrasyon: Sa teoriyadiliubos pa kay sa 100ng/ul, kon ang konsentrasyon mao ang ubos kaayo, ang kaputli mao ang kasagaran ubos dili taas

Fig9 RNA gel

Dugang pa, kung ang sample bililhon ug taas ang konsentrasyon sa RNA, girekomenda nga i-aliquot kini pagkahuman sa pagkuha, ug lasaw ang RNA sa katapusan nga konsentrasyon nga 100-300ng / ul alang sa reverse transcription.Saang proseso sa reverse transcription, sa dihang ang mRNA ma-transcribe, ang oligo (dt) nga mga primer nga espesipikong makagapos sa polyA nga mga ikog gigamit alang sa reverse transcription, samtang ang lncRNA ug circRNA naggamit sa random hexamer (Random 6 mer) nga mga primer para sa reverse transcription sa kinatibuk-ang RNA Para sa miRNA, miRNA-specific neck-loop primers gigamit alang sa reverse transcription.Daghang mga kompanya karon ang naglunsad og mga espesyal nga tailing kit.Alang sa pamaagi sa stem-loop, ang pamaagi sa tailing mas sayon, high-throughput, ug reagent-saving, apan Ang epekto sa pag-ila sa mga miRNA sa parehas nga pamilya kinahanglan dili sama ka maayo sa pamaagi sa stem-loop.Ang matag reverse transcription kit adunay mga kinahanglanon alang sa konsentrasyon sa gene-specific primers (stem-loops).Ang internal nga reperensiya nga gigamit alang sa miRNA mao ang U6.Sa proseso sa stem-loop inversion, usa ka tube sa U6 kinahanglan nga balihon gilain, ug ang atubangan ug likod nga primers sa U6 kinahanglan nga idugang direkta.Ang circRNA ug lncRNA mahimong mogamit sa mga HKG isip internal nga reperensiya.Sapagtuki sa cDNA,
kung walay problema sa RNA, ang cDNA kinahanglan usab nga maayo.Bisan pa, kung ang kahingpitan sa eksperimento gipadayon, labing maayo nga mogamit usa ka internal nga reference gene (Reference gene, RG) nga makaila sa gDNA gikan sa mga cd.Kasagaran, ang RG usa ka gene sa housekeeping., HKG) ingon sa gipakita sa Figure 10;Nianang panahona, naghimo ko og soybean storage protein, ug gigamit ang actin7 nga adunay sulod nga mga intron isip internal nga reperensiya.Ang gidak-on sa gipadako nga tipik niini nga primer sa gDNA mao ang 452bp, ug kung ang cDNA gigamit ingon usa ka template, kini 142bp.Dayon ang mga resulta sa pagsulay nakit-an nga ang Part sa cDNA kontaminado gayud sa gDNA, ug kini usab nagpamatuod nga walay problema sa resulta sa reverse transcription, ug kini mahimong gamiton isip template sa PCR.Walay kapuslanan ang pagpadagan sa agarose gel electrophoresis direkta sa cDNA, ug kini usa ka diffuse band, nga dili makapakombinsir.

Fig 10 cDNA detection

Ang pagdeterminar sa mga kondisyon sa qPCRkasagaran walay problema sumala sa protocol sa kit, nag-una sa lakang sa tm bili.Kung ang pipila ka mga primer dili maayo nga pagkadisenyo sa panahon sa primer nga disenyo, nga moresulta sa usa ka dako nga kalainan tali sa tm nga bili ug sa teoretikal nga 60 ° C, kini girekomendar nga ang cDNA Human sa mga sample sagolon, magpadagan sa usa ka gradient PCR nga adunay mga primer, ug sulayi nga likayan ang pagtakda sa temperatura nga walay mga banda ingon nga ang TM nga bili.

Pagtuki sa datos

Ang naandan nga relatibong fluorescence quantitative PCR nga pamaagi sa pagproseso sa batakan sumala sa 2-ΔΔCT.Template sa pagproseso sa datos.

May Kalabutan nga mga Produkto:

Tinuod nga Oras nga PCR Sayon^TM -Taqman

Tinuod nga Oras nga PCR Sayon^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix para sa first strand cDNA synthesis)

RT Easy II(Master Premix para sa unang strand cDNA synthesis para sa qPCR)