Ingon usa ka bag-o sa laboratoryo, dili maayo nga trabaho ang pag-screen sa mga positibo nga tanum gikan sa usa ka hugpong sa mga tanum nga adunay gamay nga rate sa pagkakabig.Una, ang DNA kinahanglan nga makuha gikan sa daghang mga sample sa usa-usa, ug dayon ang mga langyaw nga gene ma-detect sa PCR.Bisan pa, ang mga resulta kanunay nga mga blangko ug mga banda nga adunay pipila nga mga butang usahay, apan imposible nga mahibal-an kung adunay wala’y nakit-an nga mga nakit-an o sayup nga pag-ila..Wala ba kaayoy mahimo ang pag-atubang sa ingon nga proseso ug mga resulta sa eksperimento?Ayaw kabalaka, ang igsoon nagtudlo kanimo kung giunsa ang pag-screen sa mga positibo nga tanum nga transgenic nga dali ug tukma.

Lakang 1

Desinyo nga detection primers

Tinoa ang endogenous gene ug exogenous gene nga mamatikdan sumala sa sample nga sulayan, ug pagpili og representante nga 100-500bp sequence sa gene para sa primerong disenyo.Ang maayo nga mga primer makasiguro sa pagkatukma sa mga resulta sa pag-ila ug pagpamubo sa oras sa pag-ila (tan-awa ang apendise alang sa kasagarang gigamit nga mga primera sa detection).

Matikdi: Ang bag-ong gidesinyo nga mga primer kinahanglan nga ma-optimize ang mga kondisyon sa reaksyon ug pamatud-an ang katukma, katukma ug limitasyon sa pagkakita sa detection sa wala pa ang dinagkong pagkakita.

Lakang 2

Pagdesinyo sa eksperimento nga protocol

Positibo nga pagkontrol: Gamita ang giputli nga DNA nga adunay target nga tipik isip template aron mahibal-an kung normal ba ang sistema ug kondisyon sa reaksyon sa PCR.

Negatibo/blangko nga kontrol: Gamita ang DNA template o ddH2O nga walay sulod nga target fragment isip template aron mahibal-an kung adunay tinubdan sa kontaminasyon sa PCR system.

Internal nga reference control: gamita ang primer/probe nga kombinasyon sa endogenous gene sa sample nga sulayan sa pagtimbang-timbang kon ang template mahimong mamatikdan sa PCR.

Pahibalo:

Ang positibo, negatibo/blangko nga mga kontrol ug internal nga kontrol nga mga kontrol kinahanglan itakda alang sa matag pagsulay aron sa pagtimbang-timbang sa kabalido sa mga resulta sa eksperimento.

Pagpangandam sa eksperimento

Sa wala pa gamiton, tan-awa kung parehas nga gisagol ang solusyon.Kung makit-an ang ulan, kini kinahanglan nga matunaw ug isagol sumala sa mga panudlo sa dili pa gamiton.Ang 2×PCR mix kinahanglang ipa-pipette ug balik-balik nga isagol sa micropipette sa dili pa gamiton aron malikayan ang dili patas nga pag-apod-apod sa ion.

Pahibalo:

Kuhaa ang manwal ug basaha kini pag-ayo, ug paghimo og mga pagpangandam sa dili pa ang eksperimento sa higpit nga pagsunod sa mga kinahanglanon sa manwal.

Lakang 4

Pag-andam sa PCR reaction system

Sumala sa eksperimento nga protocol, isagol ang mga primer, H2O, ug 2×PCR mix parehason, centrifuge ug iapud-apod sa matag reaksyon tube.

Pahibalo:

Alang sa dinagko o dugay nga pagsulay, girekomenda nga mogamit usa ka sistema sa reaksyon sa PCR nga adunay sulud nga UNG enzyme, nga epektibo nga makalikay sa kontaminasyon sa aerosol tungod sa mga produkto sa PCR.

Lakang 5

Idugang ang template sa reaksyon

Pinaagi sa paggamit sa Direct PCR nga teknolohiya, wala'y kinahanglan alang sa makapakapoy nga proseso sa pagputli sa nucleic acid, ang sample template mahimong andamon sulod sa 10 minutos, ug ang katugbang nga PCR reaction system mahimong idugang.

Pahibalo:

Ang pamaagi sa cleavage adunay mas maayo nga epekto sa pagkakita, ug ang nakuha nga produkto mahimong magamit alang sa daghang mga reaksyon sa pagkakita.

5.1: Direktang pagpalapad sa mga dahon

Sumala sa gidak-on sa hulagway sa manwal, guntinga ang tisyu sa dahon nga adunay diyametro nga 2-3mm ug ibutang kini sa PCR reaction system.

Pahinumdom: Siguruha nga ang mga tipik sa dahon hingpit nga naunlod sa solusyon sa reaksyon sa PCR, ug ayaw idugang ang sobra nga tisyu sa dahon.

5.2: Pamaagi sa pagbahin sa dahon

Guntinga ang tisyu sa dahon nga adunay diyametro nga 5-7mm ug ibutang kini sa usa ka centrifuge tube.Kung gipili nimo ang hamtong nga mga dahon, palihug likayi ang paggamit sa mga tisyu sa panguna nga ugat sa dahon.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ngadto sa usa ka centrifuge tube aron sa pagsiguro nga ang lysate mahimong hingpit nga ituslob sa dahon tissue, ibutang kini sa usa ka thermal cycler o sa usa ka metal nga kaligoanan, ug lyse sa 95°C alang sa 5-10 minutos.

Idugang ang 50ul Buffer P2 neutralization solution ug isagol nga maayo.Ang resulta nga lysate mahimong gamiton isip template ug idugang sa PCR reaction system.

Mubo nga sulat: Ang gidaghanon sa template anaa sa taliwala sa 5-10% sa PCR system, ug dili molapas sa 20% (pananglitan, sa 20μl PCR system, idugang ang 1-2μl sa lysis solution, dili molapas sa 4μl).

Lakang 6

Reaksyon sa PCR

Human sa centrifuging sa PCR reaction tube, kini gibutang sa usa ka PCR instrument alang sa amplification.

Pahibalo:

Ang reaksyon naggamit sa non-purified template para sa amplification, mao nga ang gidaghanon sa amplification cycle maoy 5-10 pa ka cycle kay sa paggamit sa purified DNA template.

Lakang 7

Electrophoresis detection ug resulta analysis

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Giputli nga pamaagi sa DNA

2\5: Direktang paagi sa PCR

3\6: Blangko nga kontrol

QC:

Ang mga resulta sa pagsulay sa lain-laing mga kontrol nga gibutang sa eksperimento kinahanglan nga makatagbo sa mosunod nga mga kondisyon.Kay kon dili, ang hinungdan sa problema kinahanglang analisahon, ug ang pagsulay kinahanglang himoon pag-usab human mawagtang ang problema.

Talaan 1. Normal nga resulta sa pagsulay sa lain-laing mga kontrol nga grupo

* Kung ang plasmid gigamit ingon usa ka positibo nga kontrol, ang resulta sa endogenous gene test mahimong negatibo

Paghukom sa resulta:

A. Ang resulta sa pagsulay sa endogenous gene sa sample negatibo, nga nagpakita nga ang DNA nga angay alang sa ordinaryo nga PCR detection dili makuha gikan sa sample o ang gikuha nga DNA adunay PCR reaction inhibitors, ug ang DNA kinahanglan nga makuha pag-usab.

B. Ang resulta sa pagsulay sa endogenous gene sa sample positibo, ug ang resulta sa pagsulay sa exogenous gene negatibo, nga nagpakita nga ang DNA nga angay alang sa ordinaryo nga PCR detection gikuha gikan sa sample, ug kini mahimong hukman nga ang XXX gene dili makita sa sample.

C. Ang resulta sa pagsulay sa endogenous gene sa sample positibo, ug ang resulta sa pagsulay sa exogenous gene positibo, nga nagpakita nga ang DNA nga angay alang sa ordinaryo nga PCR detection gikuha gikan sa sample, ug ang sample DNA naglangkob sa XXX gene.Ang mga eksperimento sa pagkumpirma mahimo pa nga himuon.

Lakang 8

Desinyo nga detection primers

Pagkahuman sa eksperimento, gamita ang 2% nga sodium hypochlorite nga solusyon ug 70% nga solusyon sa ethanol aron mapapas ang lugar nga eksperimento aron malikayan ang polusyon sa kalikopan.