Ⅰ. Dugangi ang pagkasensitibo sa sistema sa reaksyon:

1. Ibulag ang taas nga kalidad nga RNA:

Ang malampuson nga cDNA synthesis naggikan sa taas nga kalidad nga RNA.Ang taas nga kalidad nga RNA kinahanglan nga magsiguro sa labing menos usa ka kinatibuk-an nga mas taas ug wala'y sulod nga mga inhibitor nga walay mga recording enzymes, sama sa EDTA o SDS.Ang kalidad sa RNA nagtino sa pinakataas nga bili sa sequence information nga imong ma-transcribe sa cDNA.Ang kinatibuk-ang pamaagi sa pagputli sa RNA usa ka lakang nga pamaagi sa paggamit sa isocyanate / acidophenol.Aron mapugngan ang polusyon sa RNase, ang RNA nga nahimulag gikan sa usa ka sample nga dato sa RNase (sama sa pancreas) nanginahanglan pagtipig sa formaldehyde aron makatipig sa taas nga kalidad nga RNA, nga labi pa alang sa dugay nga pagtipig.Ang RNA nga gikuha gikan sa atay sa ilaga sa batakan nadaot pagkahuman sa usa ka semana nga pagtipig sa tubig, samtang ang RNA nga nakuha gikan sa spleen sa ilaga nagpabilin nga lig-on pagkahuman sa tulo ka tuig nga pagtipig sa tubig.Dugang pa, ang mga transcript nga mas dako pa sa 4kb mas sensitibo sa pagsubay sa pagkadaut sa RNase kay sa gagmay nga mga transcript.Aron madugangan ang kalig-on sa pagtipig sa sample sa RNA, ang RNA mahimong matunaw sa usa ka methalmamine nga ion, ug gitipigan -70 °C.Ang thylide nga gigamit sa pagluwas sa RNA kinahanglan dili maglangkob sa lain-laing butang nga makadaut sa RNA.Ang RNA, nga nakuha gikan sa pancreas, mahimong matipig sa methalmamine labing menos usa ka tuig.Kung andam ka na sa paggamit sa RNA, mahimo nimong gamiton ang mosunod nga mga pamaagi sa pag-precipitate sa RNA: idugang ang NaCl sa 0.2m ug 4 ka beses ang gidaghanon sa ethanol, ibutang ang temperatura sa kwarto sa 3-5 minuto, ug 10,000 × g centrifugal sa 5 minuto.

2. Gamita ang reverse transcriptase nga walay RNaseH activity (RNaseH-):

Ang mga inhibitor sa RNase kanunay nga gidugang sa mga reverse transcription reactions aron madugangan ang gitas-on ug abot sa cDNA synthesis.Ang RNase inhibitor gidugang sa una nga kadena nga synthesis nga reaksyon sa presensya sa mga buffer ug pagkunhod sa mga ahente sama sa DTT tungod kay ang proseso sa pre-cDNA synthesis nagdenature sa inhibitor, sa ingon nagpagawas sa gigapos nga mga RNases nga nagpaubos sa RNA.Ang protina nga RNase inhibitor nagpugong lamang sa pagkadaut sa RNA pinaagi sa RNase A, B, C, ug dili makapugong sa RNases sa panit, busa pag-amping kinahanglan nga dili ipaila ang RNases gikan sa mga tudlo bisan pa sa paggamit niini nga mga inhibitor.

Ang reverse transcriptase nag-catalyze sa pagkakabig sa RNA ngadto sa cDNA.Parehong M-MLV ug AMV adunay endogenous nga kalihokan sa RNaseH dugang sa ilang kaugalingon nga kalihokan sa polymerase.Ang kalihokan sa RNaseH nakigkompetensya sa kalihokan sa polymerase alang sa mga heterozygous strand nga naporma taliwala sa mga template sa RNA ug mga primer sa DNA o mga strand sa extension sa cDNA, ug gipaubos ang RNA: RNA strands sa mga complex sa DNA.Ang mga template sa RNA nga gipaubos sa kalihokan sa RNaseH dili na magamit isip epektibo nga substrate alang sa synthesis sa cDNA, nga nagpamenos sa abot ug gitas-on sa cDNA synthesis.Sa ingon ang pagwagtang o pag-ayo sa pagkunhod sa kalihokan sa RNaseH sa reverse transcriptase mahimong dako nga kaayohan.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase sa RNaseH- ug thermoScript reverse transcriptase, AMV sa RNaseH- nakahatag ug mas full-length nga cDNA kay sa MMLV ug AMV.Ang pagkasensitibo sa RT-PCR apektado sa gidaghanon sa cDNA nga na-synthesize.Ang ThermoScript mas sensitibo kay sa AMV.Ang gidak-on sa mga produkto sa RT-PCR limitado sa abilidad sa reverse transcriptase sa pag-synthesize sa cDNA, ilabi na sa pag-clone sa mas dagkong Cdnas.Kung itandi sa MMLV, ang SuperScripⅡ labi nga nagpataas sa abot sa taas nga mga produkto sa RT-PCR.Ang reverse transcriptase sa RNaseH- nagpataas usab sa thermal stability, mao nga ang reaksyon mahimo sa mga temperatura nga mas taas kaysa normal nga 37-42 ℃.Ubos sa gisugyot nga mga kondisyon sa synthesis, ang mga primera sa oligo(dT) ug 10μCi [alpha-p]dCTP gigamit.Ang kinatibuk-ang produksiyon sa unang kadena gikalkulo gamit ang TCA precipitation method.Ang bug-os nga gitas-on nga cDNA gi-analisar gamit ang gidak-on nga gisunud nga pagtangtang sa strip ug pag-ihap sa usa ka alkaline agarose gel.

3. Dugangi ang temperatura sa pagpreserbar sa kainit sa reverse transcription:

Ang mas taas nga temperatura sa pagpugong makatabang sa pag-abli sa sekondaryang istruktura sa RNA ug pagdugang sa abot sa reaksyon.Para sa kadaghanang RNA templates, ang paghawid sa RNA ug primer sa 65°C nga walay buffer o asin ug dayon pagpabugnaw niini dayon sa yelo makawagtang sa kadaghanang sekondaryang istruktura ug motugot sa mga primera nga mabugkos.Bisan pa, ang pipila nga mga template adunay gihapon sekondaryang istruktura, bisan pagkahuman sa thermal denaturation.Ang pagpadako niining lisud nga mga templates mahimong ipahigayon gamit ang ThermoScript reverse transcriptase ug pinaagi sa pagbutang sa reverse transcriptase reaction sa mas taas nga temperatura aron mapalambo ang amplification.Ang mas taas nga temperatura sa pagkupot mahimo usab nga magpataas sa espesipiko, labi na kung ang cDNA synthesis gihimo gamit ang mga primer nga piho nga gene (GSPS) (tan-awa ang Kapitulo 3).Kung gigamit ang GSP, siguroha nga ang Tm nga kantidad sa primer parehas sa gipaabut nga temperatura sa pagtipig.Ayaw gamita ang oligo(dT) ug random nga mga primer nga labaw sa 60 ℃.Ang mga random nga primer kinahanglan nga ipahigayon sa 25 ℃ sulod sa 10 ka minuto sa dili pa motaas ngadto sa 60 ℃.Dugang pa sa paggamit sa mas taas nga reverse transcription nga temperatura, ang espesipiko mahimong mapauswag pinaagi sa direktang pagbalhin sa RNA/ primer mixture gikan sa 65 ℃ denaturing temperature ngadto sa reverse transcription holding temperature ug pagdugang ug preheated 2× reaction mixture (cDNA thermal initiation synthesis).Kini nga pamaagi makatabang sa pagpugong sa intermolecular base pagpares nga mahitabo sa ubos nga temperatura.Ang paggamit sa instrumento sa PCR nagpasimple sa daghang mga switch sa temperatura nga gikinahanglan alang sa RT-PCR.

Ang Tth heat stabilized polymerase naglihok isip DNA polymerase sa presensya sa Mg2+ ug RNA polymerase sa presensya sa Mn2+.Kini makapugong sa kainit hangtod sa 65 ℃.Bisan pa, ang presensya sa Mn2 + sa panahon sa PCR nagpamenos sa pagkamatinud-anon, nga naghimo sa Tth polymerase nga dili kaayo angay alang sa taas nga katukma nga pagpadako, sama sa cDNA cloning.Dugang pa, ang Tth dili kaayo episyente sa reverse transcription, nga makapakunhod sa pagkasensitibo, ug tungod kay ang usa ka enzyme makahimo sa reverse transcription ug PCR, ang pagkontrol sa mga reaksyon nga walay reverse transcription dili magamit sa pag-ila sa mga amplified nga produkto sa cDNA gikan sa kontaminado nga genomic DNA.

4. Additive nga nagpasiugda sa reverse transcription:

Ang pagdugang sa mga additives, lakip ang glycerin ug DMSO, sa unang kadena nga synthesis nga reaksyon makapakunhod sa kalig-on sa nucleic acid double strand ug makawala sa RNA secondary structure.Hangtod sa 20% glycerin o 10% DMSO mahimong idugang nga dili makaapekto sa kalihokan sa SuperScriptⅡ o MMLV.Ang AMV mahimo usab nga motugot hangtod sa 20% nga glycerol nga wala’y pagkunhod sa kalihokan.Aron mapadako ang pagkasensitibo sa RT-PCR sa SuperScriptⅡ reverse transcription reaction, 10% glycerol mahimong idugang ug insulated sa 45 ℃.Kung ang 1/10 sa retrotranscription-reaksyon nga produkto idugang sa PCR, ang konsentrasyon sa glycerol sa amplification reaksyon mao ang 0.4%, nga dili igo aron mapugngan ang PCR.

5. Pagproseso sa RNaseH:

Ang pagkasensitibo mahimong mapauswag pinaagi sa pagtambal sa mga reaksyon sa synthesis sa cDNA nga adunay RNaseH sa wala pa ang PCR.Alang sa pipila ka mga templates, gituohan nga ang RNA sa cDNA synthesis nga reaksyon nagpugong sa pagbugkos sa mga amplified nga mga produkto, diin ang RNaseH nga pagtambal makadugang sa pagkasensitibo.Kasagaran, gikinahanglan ang pagtambal sa RNaseH alang sa pagpadako sa medyo taas nga full-length nga cDNA target template, sama sa tuberous scherosisⅡ nga adunay gamay nga kopya.Alang niining lisud nga template, gipauswag sa RNaseH ang signal nga gihimo sa cDNA nga gi-synthesize sa SuperScriptⅡ o AMV.Alang sa kadaghanan nga mga reaksyon sa RT-PCR, ang pagtambal sa RNaseH opsyonal tungod kay ang 95 ℃ nga insulated PCR denaturation nga lakang kasagarang nag-hydrolyze sa RNA gikan sa RNA: DNA complex.

6. Gipauswag nga mga pamaagi sa pag-ila sa gamay nga kantidad sa RNA:

Ang RT-PCR labi nga mahagiton kung gamay ra nga kantidad sa RNA ang magamit.Ang pagdugang sa glycogen ingon usa ka carrier sa panahon sa pagbulag sa RNA makatabang sa pagdugang sa ani sa gagmay nga mga sample.Ang usa ka glycogen nga wala’y RNase mahimong idugang sa parehas nga oras sa Trizol.Ang glycogen matunaw sa tubig ug mahimong magpabilin sa yugto sa tubig nga adunay RNA aron makatabang sa sunod nga pag-ulan.Ang girekomendar nga konsentrasyon sa RNase-free glycogen mao ang 250μg/ml alang sa mga sample nga ubos pa sa 50mg sa tissue o 106 ka kultura nga mga selula.

Ang pagdugang sa acetylated BSA aron balihon ang mga reaksyon sa transkripsyon gamit ang SuperScriptⅡ makadugang sa pagkasensitibo, ug alang sa gamay nga kantidad sa RNA, ang pagkunhod sa kantidad sa SuperScriptⅡ ug pagdugang sa 40 nga yunit sa RnaseOut nuclease inhibitor makapauswag sa lebel sa pagkakita.Kung ang glycogen gigamit sa pagbulag sa RNA, ang pagdugang sa BSA o RNase inhibitor aron balihon ang mga reaksyon sa transkripsyon gamit ang SuperScriptⅡ girekomenda gihapon.

Ⅱ. Dugangi ang espesipiko sa RT-PCR

1. cNDA synthesis:

Tulo ka lain-laing mga pamaagi mahimong gamiton sa pagsugod sa unang strand cDNA synthesis, ug ang relatibong espesipiko sa matag pamaagi makaapekto sa gidaghanon ug matang sa cDNA synthesized.

Ang random primer nga pamaagi mao ang pinakagamay nga espesipiko sa tulo ka mga pamaagi.Ang mga primer gi-annealed sa daghang mga site sa tibuok transcript aron makahimo og mubo, partial nga gitas-on nga cDNA.Kini nga pamaagi kasagarang gigamit aron makakuha og 5′ terminal sequence ug cDNA gikan sa RNA templates nga adunay secondary structural regions o uban sa pagtapos sa mga site nga ang reverse transcriptase dili maka-replicate.Aron makuha ang pinakataas nga cDNA, ang ratio sa mga primer sa RNA sa matag sample sa RNA kinahanglan nga matino sa empirikal nga paagi.Ang inisyal nga konsentrasyon sa random primers gikan sa 50 ngadto sa 250ng kada 20μl reaction system.Tungod kay ang cDNA nga gi-synthesize gikan sa kinatibuk-ang RNA gamit ang random nga mga primer kay kasagaran ribosomal RNA, ang poly(A)+RNA kasagarang gipili isip template.

Ang pagsugod sa Oligo(dT) mas espesipiko kay sa mga random nga primer.Nag-hybrid kini sa poly(A) nga ikog nga makita sa 3′ nga tumoy sa mRNA sa kadaghanang eukaryotic cells.Tungod kay ang poly(A)+RNA maoy halos 1% ngadto sa 2% sa kinatibuk-ang RNA, ang gidaghanon ug pagkakomplikado sa cDNA mas ubos kay sa kung random nga mga primer ang gigamit.Tungod sa taas nga espesipiko niini, ang oligo(dT) sa kasagaran wala magkinahanglan og optimization alang sa RNA sa primer ratio ug poly(A)+ nga pagpili.Girekomenda nga gamiton ang 0.5μg oligo(dT) kada 20μl reaction system.Ang oligo(dT)12-18 angay alang sa kadaghanan sa RT-PCR.Ang ThermoScript RT-PCR System naghatag og oligo(dT)20 tungod sa maayo nga thermal stability niini ug angay alang sa mas taas nga temperatura sa paghawid.

Ang gene-specific primers (GSP) mao ang pinakamaayong espesipikong primer para sa reverse transcription nga lakang.Ang GSP usa ka antisense oligonucleoside nga espesipikong mag-hybrid sa mga han-ay sa destinasyon sa RNA, imbes nga i-anne ang tanang Rnas sama sa random nga primers o oligo(dT).Ang mga lagda nga gigamit sa pagdesinyo sa mga primer sa PCR magamit usab sa disenyo sa reverse transcription reaction GSP.Ang GSP mahimong parehas nga han-ay sa amplification primer nga gi-annealed sa katapusan sa mRNA3′, o GSP mahimong gidisenyo nga annealed downstream gamit ang reverse amplification primer.Alang sa pipila nga gipakusog nga mga butang, gikinahanglan ang pagdesinyo ug labaw sa usa ka antisense primer para sa malampuson nga RT-PCR tungod kay ang sekondaryang istruktura sa target nga RNA mahimong makapugong sa primer sa pagbugkos.Gisugyot nga gamiton ang 1pmol antisense GSP sa unang sistema sa reaksyon sa kadena nga synthesis sa 20μl.

2. Dugangi ang temperatura sa pagpreserbar sa kainit sa reverse transcription:

Aron mapahimuslan sa hingpit ang espesipiko sa GSP, ang reverse transcriptase nga adunay taas nga thermal stability kinahanglan gamiton.Ang heat-stable nga reverse transcriptase mahimong ma-insulated sa mas taas nga temperatura aron madugangan ang reaksyon sa kahigpit.Pananglitan, kung ang usa ka GSP gi-annealed sa 55 ° C, nan ang espesipiko sa GSP dili hingpit nga magamit kung ang reverse transcription gihimo sa 37 ° C nga adunay ubos nga kahigpit gamit ang AMV o M-MLV.Bisan pa, ang SuperScripⅡ ug ThermoScript mahimong mo-react sa 50 ℃ o mas taas, nga magwagtang sa dili piho nga mga produkto nga gihimo sa mas ubos nga temperatura.Para sa pinakataas nga espesipiko, ang RNA/ primer mixture mahimong direktang ibalhin gikan sa 65 ℃ denaturation temperature ngadto sa reverse transcription holding temperature uban ang dugang nga preheated 2 x reaction mixture (thermal initiation sa cDNA synthesis).Makatabang kini sa pagpugong sa pagpares sa base tali sa mga molekula sa ubos nga temperatura.Ang paggamit sa instrumento sa PCR nagpasimple sa daghang mga pagbag-o sa temperatura nga gikinahanglan alang sa RT-PCR.

3. Pagpakunhod sa kontaminasyon sa genomic DNA:

Usa ka potensyal nga kalisud sa RT-PCR mao nga ang RNA makahugaw sa genomic DNA.Ang paggamit sa mas maayo nga mga pamaagi sa pagbulag sa RNA, sama sa Trizol Reagent, makapamenos sa kontaminasyon sa genomic DNA sa mga pagpangandam sa RNA.Aron malikayan ang mga produkto nga gihimo gikan sa genomic DNA, ang RNA mahimong pagtratar sa amplification grade DnasⅠ aron makuha ang kontaminado nga DNA sa dili pa ibalik ang transkripsyon.Ang mga sampol gitipigan sa 65 ℃ sa 2.0mM EDTA sulod sa 10 min aron tapuson ang DNaseⅠ digestion.Gi-chelate sa EDTA ang mga magnesium ion aron mapugngan ang magnesium ion nga nagsalig sa RNA hydrolysis nga mahitabo sa taas nga temperatura.

Aron mabulag ang gipadako nga cDNA gikan sa produkto nga amplification sa genome DNA, ang mga primer nga gilain nga mag-anne sa gibulag nga exon mahimong idisenyo.Ang mga produkto sa PCR nga nakuha gikan sa cDNA mas mubu kaysa sa nakuha gikan sa kontaminado nga genomic DNA.Ang usa ka kontrolado nga eksperimento nga walay reverse transcription gihimo usab sa matag RNA template aron mahibal-an kung ang gihatag nga tipik gikan ba sa genomic DNA o cDNA.Ang mga produkto sa PCR nga nakuha kung wala ang reverse transcription nakuha gikan sa genome.

May Kalabutan nga Produkto

RT-PCR Sayon^ᵀᴹAko (Usa ka Lakang)

-Ang one-step kit makapahimo sa reverse transcription ug PCR nga ipahigayon sa samang tubo.Kinahanglan lang nga idugang ang template nga RNA, piho nga mga primer sa PCR ug RNase-Free ddH₂O.

-Real-time nga quantitative analysis sa RNA mahimo nga dali ug tukma.

-Ang kit naggamit sa usa ka talagsaon nga Foregene reverse transcription reagent ug Foregene HotStar Taq DNA Polymerase nga gihiusa uban sa usa ka talagsaon nga sistema sa reaksyon aron epektibong mapauswag ang pagkaayo sa amplification ug espesipiko sa reaksyon.

-Ang na-optimize nga sistema sa reaksyon naghimo sa reaksyon nga adunay mas taas nga pagkasensitibo sa detection, mas lig-on nga thermal stability, ug mas maayo nga pagkamatugtanon.

RT Easy II(With GDNase) Master Premix Para sa First-Strand CDNA Synthesis Para sa Real Time PCR Uban sa GDNase

-Episyente nga abilidad sa pagtangtang sa gDNA, nga makatangtang sa gDNA sa template sulod sa 2 ka minuto.

-Episyente nga reverse transcription system, nagkinahanglan lamang kini og 15 minutos aron makompleto ang synthesis sa unang strand cDNA.

-Komplex nga mga template: ang mga template nga adunay taas nga GC nga sulud ug komplikado nga sekondaryang istruktura mahimo usab nga balihon nga adunay taas nga kahusayan.

-High-sensitivity reverse transcription system, pg-level templates mahimo usab nga makakuha og taas nga kalidad nga cDNA.

-Ang reverse transcription system adunay taas nga thermal stability, ang kamalaumon nga temperatura sa reaksyon mao ang 42 ℃, ug kini adunay maayo nga reverse transcription performance sa 50 ℃.