1. Batakang kahibalo (kung gusto nimo makita ang eksperimento nga bahin, palihug pagbalhin direkta sa ikaduhang bahin)
Ingon usa ka gigikanan nga reaksyon sa naandan nga PCR, ang tinuud nga oras nga PCR nag-una nga nag-monitor sa pagbag-o sa kantidad sa produkto sa amplification sa matag siklo sa reaksyon sa pagpadako sa PCR sa tinuud nga oras pinaagi sa pagbag-o sa signal sa fluorescence, ug gisusi sa quantitatively ang pagsugod nga template pinaagi sa relasyon tali sa kantidad sa ct ug sa standard curve.
Ang piho nga datos sa RT-PCR mao angbaseline, fluorescence thresholdugCt nga bili.
| baseline: | Ang fluorescence value sa 3rd-15th cycle mao ang baseline (baseline), nga tungod sa panagsa nga sayop sa pagsukod. |
| Threshold (sukaranan): | Nagtumong sa limitasyon sa pag-ila sa fluorescence nga gitakda sa angay nga posisyon sa exponential growth region sa amplification curve, kasagaran 10 ka beses ang standard deviation sa baseline. |
| CT nga bili: | Kini ang gidaghanon sa mga siklo sa PCR kung ang kantidad sa fluorescence sa matag tubo sa reaksyon moabot sa threshold. Ang Ct nga bili kay inversely proportional sa kantidad sa inisyal nga template. |
Kasagaran nga mga pamaagi sa pagmarka alang sa RT-PCR:
| pamaagi | bentaha | kakulangan | sakup sa aplikasyon |
| SYBR BerdeⅠ | Wide applicability, sensitibo, barato ug sayon | Ang mga kinahanglanon sa primer taas, dali sa dili piho nga mga banda | Angayan kini alang sa quantitative analysis sa lain-laing target genes, research sa gene expression, ug research sa transgenic recombinant nga mga mananap ug mga tanom. |
| TaqMan | Maayo nga specificity ug taas nga repeatability | Taas ang presyo ug angay lamang alang sa piho nga mga katuyoan. | Pathogen detection, drug resistance gene research, drug efficacy assessment, diagnosis sa genetic nga mga sakit. |
| molekular nga beacon | Taas nga espesipiko, fluorescence, ubos nga background | Taas ang presyo, angay lamang kini sa usa ka piho nga katuyoan, lisud ang disenyo, ug taas ang presyo. | Piho nga pagtuki sa gene, pagtuki sa SNP |
2. Eksperimental nga mga lakang
2.1 Mahitungod sa eksperimento nga paggrupo- kinahanglan adunay daghang mga atabay sa grupo, ug kinahanglan adunay biolohikal nga pagbalik-balik.
| ① | Blangko nga kontrol | Gigamit aron mahibal-an ang kahimtang sa pagtubo sa cell sa mga eksperimento |
| ② | Negatibo nga pagkontrol sa siRNA (non-specific siRNA sequence) | Ipakita ang espesipiko sa aksyon sa RNAi.Ang siRNA mahimong mag-aghat sa dili piho nga tubag sa stress sa usa ka konsentrasyon nga 200nM. |
| ③ | Pagkontrol sa Transfection Reagent | Dili iapil ang toxicity sa transfection reagent sa mga selula o ang epekto sa pagpahayag sa target nga gene |
| ④ | siRNA batok sa target nga gene | Ipaubos ang ekspresyon sa target nga gene |
| ⑤ (opsyonal) | positibo nga siRNA | Gigamit sa pag-troubleshoot sa sistema sa eksperimento ug mga problema sa operasyon |
| ⑥ (opsyonal) | Fluorescent control siRNA | Ang kaepektibo sa pagbalhin sa selula mahimong maobserbahan gamit ang mikroskopyo |
2.2 Mga Prinsipyo sa primerong disenyo
| Gipadako nga gidak-on sa tipik | Labing maayo sa 100-150bp |
| Panguna nga Gitas-on | 18-25bp |
| GC nga sulod | 30% -70%, labing maayo nga 45% -55% |
| Tm bili | 58-60 ℃ |
| Pagkasunodsunod | Likayi ang T/C nga padayon;A/G padayon |
| 3 katapusan nga han-ay | Likayi ang GC rich o AT rich;ang terminal base mas maayo nga G o C;labing maayo nga likayan ang T |
| Pagkakomplementar | Likayi ang komplementaryong pagkasunodsunod nga labaw sa 3 ka base sulod sa primer o tali sa duha ka primer |
| Espesipiko | Gamita ang blast search para makumpirma ang primer specificity |
①Ang SiRNA maoy espesipiko sa espisye, ug ang mga han-ay sa lain-laing mga espisye magkalahi.
②SiRNA giputos sa freeze-dry powder, nga mahimong tipigan nga lig-on sulod sa 2-4 ka semana sa temperatura sa lawak.
2.3 Mga himan o reagents nga kinahanglang andamon daan
| Primer (internal nga pakisayran) | Naglakip sa unahan ug balik nga duha |
| Mga primer (target nga gene) | Naglakip sa unahan ug balik nga duha |
| Target Si RNA (3 strips) | Kasagaran, ang kompanya mag-synthesize sa 3 nga mga piraso, ug dayon pilia ang usa sa tulo pinaagi sa RT-PCR |
| Kit sa Pagbalhin | Lipo2000 ug uban pa. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Alang sa pagkuha sa RNA pagkahuman sa pagbalhin |
| Rapid Reverse Transcription Kit | alang sa cDNA synthesis |
| PCR Amplification Kit | 2×Super SYBR Berde qPCR Master Mix |
2.4 Mahitungod sa mga isyu nga kinahanglan nga hatagan ug pagtagad sa piho nga mga lakang sa eksperimento:
①siRNA transfection proseso
1. Para sa plating, makapili ka ug 24-well plate, 12-well plate o 6-well plate (ang kasagaran nga konsentrasyon sa RNA nga gisugyot sa matag atabay sa 24-well plate kay mga 100-300 ng/uL), ug ang kamalaumon nga transfection density sa mga selula hangtod sa 60 % -80% o labaw pa.
2. Ang mga lakang sa pagbalhin ug espesipikong mga kinahanglanon hugot nga nahisubay sa mga instruksyon.
3. Human sa transfection, ang mga sample mahimong makolekta sulod sa 24-72 ka oras para sa mRNA detection (RT-PCR) o protein detection sulod sa 48-96 hours (WB)
② Proseso sa pagkuha sa RNA
1. Paglikay sa kontaminasyon sa mga exogenous enzymes.Nag-una kini sa pagsul-ob og mga maskara ug gwantes nga hugot;gamit ang sterilized pipette tips ug EP tubes;ang tubig nga gigamit sa eksperimento kinahanglan nga RNase-Free.
2. Kini girekomendar sa pagbuhat sa makaduha sama sa gisugyot sa dali nga pagkuha kit, nga makapauswag gayud sa kaputli ug abot.
3. Ang hugaw nga likido kinahanglang dili makahikap sa RNA column.
③ RNA quantification
Human makuha ang RNA, mahimo kining ma-quantified direkta sa Nanodrop, ug ang minimum nga pagbasa mahimong ubos sa 10ng/ul.
④ Balikbalik nga proseso sa transkripsyon
1. Tungod sa taas nga pagkasensitibo sa RT-qPCR, labing menos 3 ka parallel wells ang kinahanglang himoon para sa matag sample aron mapugngan ang sunod nga Ct nga lahi ra kaayo o ang SD nga dako kaayo para sa statistical analysis.
2. Ayaw pag-freeze ug pagtunaw sa Master mix balik-balik.
3. Ang matag tubo/lungag kinahanglang pulihan ug bag-ong tip!Ayaw gamita kanunay ang parehas nga tip sa pipette aron makadugang mga sample!
4. Ang pelikula nga gilakip sa 96-well plate human sa pagdugang sa sample kinahanglan nga smoothed sa usa ka plato.Labing maayo nga mag-centrifuge sa dili pa ibutang kini sa makina, aron ang likido sa bungbong sa tubo makadagayday ug matangtang ang mga bula sa hangin.
⑤Komon nga pagtuki sa kurba
| Walay panahon sa logarithmic nga pagtubo | Posible nga taas nga konsentrasyon sa template |
| Walay CT value | Sayop nga mga lakang sa pag-ila sa fluorescent signal; pagkadaot sa mga primer o probes - ang integridad niini mamatikdan sa PAGE electrophoresis; dili igo nga kantidad sa template; pagkadaut sa mga templates - paglikay sa pagpaila sa mga hugaw ug balik-balik nga pagyelo ug pagtunaw sa sample nga pag-andam; |
| Ct>38 | Ubos nga amplification efficiency;Ang produkto sa PCR taas kaayo;Ang lainlaing mga sangkap sa reaksyon nadaot |
| Linear amplification curve | Ang mga pagsusi mahimong partially degraded pinaagi sa balik-balik nga freeze-thaw cycle o dugay nga exposure sa kahayag |
| Ang kalainan sa doble nga mga lungag labi ka dako | Ang reaksyon nga solusyon dili hingpit nga natunaw o ang reaksyon nga solusyon dili gisagol;ang thermal bath sa PCR instrument kontaminado sa fluorescent substances |
2.5 Mahitungod sa pagtuki sa datos
Ang pag-analisa sa datos sa qPCR mahimong bahinon sa relatibong quantification ug absolute quantification.Pananglitan, ang mga selula sa grupo sa pagtambal kon itandi sa mga selula sa kontrol nga grupo,
Pila ka beses nga ang mRNA sa X gene mausab, kini mao ang relatibong quantification;sa usa ka piho nga gidaghanon sa mga selula, ang mRNA sa X gene
Pila ka kopya ang naa, kini hingpit nga pag-ihap.Kasagaran ang labing gigamit namon sa laboratoryo mao ang relatibong quantitative nga pamaagi.Kasagaran,ang 2-ΔΔct nga pamaagigigamit sa kadaghanan sa mga eksperimento, mao nga kini nga pamaagi lamang ang ipaila sa detalye dinhi.
2-ΔΔct nga pamaagi: Ang resulta nga nakuha mao ang kalainan sa ekspresyon sa target nga gene sa eksperimento nga grupo kalabot sa target nga gene sa kontrol nga grupo.Gikinahanglan nga ang amplification efficiencies sa target gene ug sa internal reference gene duol sa 100%, ug ang relative deviation kinahanglan dili molapas sa 5%.
Ang pamaagi sa kalkulasyon mao ang mosunod:
Δct control group = ct value sa target gene sa control group - ct value sa internal reference gene sa control group
Δct experimental group = ct value sa target gene sa experimental group - ct value sa internal reference gene sa experimental group
ΔΔct=Δct experimental group-Δct control group
Sa katapusan, kuwentaha ang daghang kalainan sa lebel sa ekspresyon:
Usba ang Fold=2-ΔΔct (katugbang sa excel function kay POWER)
May kalabotan nga mga produkto:
Panahon sa pag-post: Mayo-20-2023
