Ang mga tradisyonal nga reverse transcriptases dili makatugot sa taas nga temperatura (ang kamalaumon nga temperatura alang sa kalihokan sa MMLV mao ang 37-50 ° C, ug ang AMV mao ang 42-60 ° C).Ang mas komplikado nga viral RNA dili mahimong epektibo nga balihon nga ma-transcribe ngadto sa cDNA sa ubos nga temperatura, nga moresulta sa detection efficiency Ang pagkunhod.Ang tradisyonal nga RT-qPCR sa kasagaran nagkinahanglan sa partisipasyon sa duha ka yawe nga mga enzyme (reverse transcriptase ug DNA polymerase), nga naghimo niini nga imposible nga pasimplehon ang operasyon sa reaksyon nga sistema ug pagpakunhod sa gasto.Dinhi atong ipaila ang duha ka high-temperature-resistant reverse transcriptases, TtH ug RevTaq.Kining duha ka enzyme usab adunay function sa DNA polymerase, mao nga sila gitawag nga bifunctional enzymes.

TtH DNA polymerase

Tingali nakadungog ka bahin sa TtH, nga nakuha gikan sa thermophilic bacterium nga Thermus thermophilus HB8.Sa presensya sa mga divalent cations sama sa Mg2+, kini adunay DNA polymerase nga kalihokan.Kaylap kini nga gigamit sa mga reaksiyon sa PCR sama sa Taq enzyme, apan kini adunay mas taas nga resistensya sa kainit kay sa Taq enzyme, busa kini usab adunay mas maayo nga epekto sa PCR nga adunay taas nga GC content templates.

· Kini nga enzyme sa batakan walay 3′→5′ exonuclease nga kalihokan ug 5′→3′ exonuclease nga kalihokan, mao nga kini magamit usab sa dideoxy sequencing.

· Kini nga enzyme adunay kalihokan sa RTase.Sa presensya sa Mn2+, ang kalihokan sa RTase mapalambo.Gamit kini nga bahin, mahimo kining gamiton sa paghimo sa reverse transcription reaction ug PCR reaction sa samang tubo, nga mao, one-step RT-PCR.Bisan pa, sa presensya sa Mn2 +, ang katukma sa RT-PCR dili taas.Ang kalihokan sa RT walay kalabotan sa kalihokan sa rnaase H.

· Ang dugang nga kalihokan sa Tth-DNA polymerase (pH9, labing taas nga +55℃～+70℃, maximum +95℃) nakabuntog sa mga problema tungod sa RNA secondary structure.Ang resulta nga cDNA mahimong mapadako pinaagi sa PCR nga adunay parehas nga enzyme sa presensya sa Mg2+ ion.

· Ang abilidad sa Tth-DNA polymerase sa paghimo sa reverse transcription ug DNA amplification sa taas nga temperatura naghimo niini nga enzyme nga mapuslanon alang sa quantitative RT-PCR, cloning, ug gene expression analysis sa cellular ug viral RNA.
· Ang Tth-DNA polymerase gigamit alang sa RT-PCR aron mapadako ang RNA hangtod sa 1kb.

Mga bahin ug bentaha

Tth DNA polymerase:

• Siguradoha ang gi-optimize nga polymerase chain reaction (PCR) nga gidak-on sa produkto, labing menos 1000 bp sa RT-PCR reaction

• Dawata ang giusab nga deoxyribonucleoside triphosphate isip substrate

• Wala'y kalabutan sa kalihokan sa RNase H

• Adunay taas nga kalig-on sa kainit aron mabuntog ang mga problema, kasagaran may kalabotan sa taas nga sekondaryang istruktura nga naa sa RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

Usa ka heat-resistant nga DNA polymerase nga adunay reverse transcriptase nga kalihokan

Ang RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase kay usa ka engineered, highly heat-resistant, dual-functional enzyme nga adunay reverse transcriptase ug DNA polymerase nga mga kalihokan nga nakuha pinaagi sa direkta ug artipisyal nga ebolusyon.

· Ang katunga sa kinabuhi sa RevTaq RT-PCR DNA polymerase sa 95°C labaw pa sa 40 minutos.

· Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase nagtugot sa taas nga temperatura nga reverse transcription direkta gikan sa RNA template, ug ang reverse transcription nga lakang mahimong balik-balikon sa makadaghang higayon aron makamugna og mas daghang cDNA templates.

· Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase nagtugot sa “zero-step” RT-PCR (walay isothermal reverse transcription step), tungod kay sa cyclic PCR extension step, ang reverse transcription ug DNA amplification mahitabo dungan.Gipasiugda usab niini ang reverse transcription reaction sa taas nga temperatura, sa ingon maminusan ang mga problema nga nasugatan sa pagtunaw sa lig-on nga sekondaryang istruktura sa RNA sa taas nga temperatura.

· Tungod sa aptamer-based nga hot-start nga pormula, ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase makahatag ug mas maayong resulta kon ang annealing ug extension nga temperatura mas taas kay sa 57°C.

· Tungod kay ang enzyme dili makasugakod sa kainit, girekomendar ang pagdesinyo sa mga primera ug mga probe nga adunay taas kaayo nga mga punto sa pagkatunaw (>60°C).

· Girekomenda nga i-optimize ang temperatura sa annealing/extension nga lakang pinaagi sa gradient sa temperatura sa panahon sa proseso sa pag-setup sa reaksyon.

· Kon mas taas ang temperatura, mas taas ang specificity sa PCR.Ang reverse transcription cycle kasagarang gihimo sa mas taas nga temperatura kay sa PCR cycle, tungod kay ang DNA Primer: RNA Template hybridization kasagaran adunay mas taas nga melting point kay sa DNA Primer: cDNA Template duplex.

· Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase kay genetically engineered ug optimized, ug ang amplicon size kay tali sa 60-300 bp.

Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase detection limit moabot sa 4 ka kopya/

Ang na-optimize nga sistema sa reaksyon (ang pagtukod sa taas nga mga primer sa pagtunaw) gipakita sa numero.Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase-driven RT-PCR nagpakita ug mas maayong pagkasensitibo kay sa TaqPath 1-step RT-qPCR master mix, ug ubos nga detection Sample dilution gradient.

Dugang nga mga bentaha:

Dali nga pagsugod function → Ang inisyal nga thermal denaturation nga lakang mahimong laktawan.

Hot-start aptamer formula → Hatagi dayon ang 100% nga kalihokan sa enzyme ug pugngan ang dili piho nga pagpadako sa ubos nga temperatura (<57°C).

Cleavage function → Ang lakang sa pagkuha sa RNA wala iapil, tungod kay ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase mahimo usab nga magproseso sa mga sample sa krudo nga reaksyon.Makaguba dayon kini sa mga lamad sa selula sa mga eukaryote, bakterya ug mga virus sa init nga siklo sa RT-PCR.

IVD nga hilaw nga materyal nga lebel → taas nga kalidad nga mga sumbanan ug hilabihan nga kompetisyon nga mga presyo