Panguna nga sukaranan sa disenyo (99% nga mga problema mahimong masulbad)
1. Panguna nga gitas-on: Ang libro nagkinahanglan og 15-30bp, kasagaran mga 20bp.Ang aktuwal nga kahimtang mao ang mas maayo nga mahimong 18-24bp aron sa pagsiguro sa specificity, apan ang mas taas nga ang mas maayo, taas kaayo nga primer makapakunhod usab sa specificity, ug pagpakunhod sa abot.
2. Primer amplification span: Ang 200-500bp ang angay, ug ang tipik mahimong mapalapad ngadto sa 10kb ubos sa piho nga mga kondisyon.
3. Primer base: Ang sulod sa G + C kinahanglan nga 40-60%, gamay kaayo G + C amplification epekto dili maayo, sobra ka G + C mao ang sayon nga makita dili piho nga mga banda.Ang ATGC labing maayo nga giapod-apod nga random, paglikay sa mga pungpong nga labaw sa 5 purine o pyrimidine nucleotides.Multi-gc para sa 5′ end ug intermediate sequence aron madugangan ang kalig-on, likayan ang dato nga GC sa 3′ end, walay GC para sa kataposang 3 base, o walay GC para sa 3 sa kataposang 5 nga base.
4. Likayi ang sekondaryang istruktura sa mga primer, ug likayi ang komplementasyon tali sa duha ka primer, ilabina ang komplementasyon sa 3 'katapusan, kon dili ang primer dimer maporma ug ang dili piho nga amplified bands mamugna.
5. Ang mga base sa 3 'katapusan sa mga primer, labi na ang katapusan ug penultimate nga mga base, kinahanglan nga hugot nga ipares aron malikayan ang kapakyasan sa PCR tungod sa wala gipares nga mga base sa terminal.
6. Ang mga primer adunay o mahimong idugang uban ang angay nga mga cleavage site, ug ang gipadako nga target sequence kinahanglan nga adunay tukma nga cleavage site, nga mapuslanon kaayo alang sa cleavage analysis o molecular cloning.
7. Espesipiko sa mga primer: ang mga primer kinahanglan walay klaro nga homology sa ubang mga han-ay sa nucleic acid sequence database.
8. Pagkat-on sa paggamit sa software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Kini nga online nga disenyo labing maayo).
Ang sulod sa ibabaw makasulbad ug labing menos 99% sa mga problema sa primerong disenyo.
Kontrola ang mga detalye sa primerong disenyo
1. Panguna nga gitas-on
Kinatibuk-ang primer nga gitas-on mao ang 18 ~ 30 base.Sa kinatibuk-an, ang labing importante nga butang nga nagtino sa annealing temperatura sa primer mao ang gitas-on sa primer.Ang annealing temperature sa primer kasagarang gipili (Tm value -5 ℃), ug ang uban direktang naggamit sa Tm value.Ang mosunod nga mga pormula mahimong gamiton sa halos pagkalkulo sa annealing temperature sa mga primer.
Sa diha nga ang gitas-on sa primer mao ang ubos pa kay sa 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Sa diha nga ang gitas-on sa primer mao ang labaw pa kay sa 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (%GC) -500/gitas-on-5 ℃
Dugang pa, daghang software ang mahimo usab nga gamiton sa pagkalkulo sa annealing temperature, ang prinsipyo sa kalkulasyon magkalahi, mao nga usahay ang kalkulado nga bili mahimong adunay gamay nga gintang.Aron ma-optimize ang mga reaksyon sa PCR, ang pinakamubo nga mga primer nga nagsiguro sa mga temperatura sa pag-anil nga dili moubos sa 54 ℃ gigamit alang sa labing maayo nga kahusayan ug piho.
Sa kinatibuk-an, ang primer nga espesipiko nagdugang sa usa ka butang nga upat alang sa matag dugang nga nucleotide, aron ang minimum nga gitas-on sa primer para sa kadaghanan nga mga aplikasyon mao ang 18 ka mga nucleotide.Ang taas nga limitasyon sa gitas-on sa primer dili kaayo importante, nag-una nga may kalabutan sa kaepektibo sa reaksyon.Tungod sa entropy, mas taas ang primer, mas ubos ang gikusgon niini aron mabugkos sa target nga DNA aron maporma ang usa ka stable nga double-stranded template aron mabugkos ang DNA polymerase.
Kung gigamit ang software sa pagdesinyo sa mga primer, ang gitas-on sa mga primer mahimong matino sa kantidad sa TM, labi na alang sa mga primer sa fluorescence quantitative PCR, TM = 60 ℃ o labaw pa kinahanglan nga kontrolon.
2.GC nga sulod
Sa kinatibuk-an, ang sulod sa G+C sa primer sequence mao ang 40%~60%, ug GC content ug Tm bili sa usa ka parisan sa primers kinahanglan coordinated.Kung ang primer adunay usa ka seryoso nga GC o AT tendency, ang angay nga kantidad sa A, T o G ug C nga ikog mahimong idugang sa 5 'katapusan sa primer.
3. Pag-ani sa temperatura
Ang annealing temperatura kinahanglan nga 5 ℃ ubos pa kay sa unchain temperatura.Kung gamay ra ang gidaghanon sa mga base sa primer, ang temperatura sa annealing mahimo’g madugangan nga tukma, nga mahimo’g madugangan ang espesipiko sa PCR.Kung ang gidaghanon sa mga base dako, ang temperatura sa annealing mahimong mapakunhod sa tukmang paagi.Ang kalainan sa temperatura sa annealing tali sa usa ka parisan sa mga primer nga 4 ℃ ~ 6 ℃ dili makaapekto sa ani sa PCR, apan ang labing maayo nga temperatura sa annealing sa usa ka parisan sa mga primero parehas, nga mahimong magkalainlain tali sa 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Likayi ang secondary structure area sa amplification template
Labing maayo nga likayan ang sekondaryang istruktura nga rehiyon sa template kung gipili ang gipadako nga tipik.Ang lig-on nga sekondaryang istruktura sa target nga tipik mahimong matagna ug mabanabana sa may kalabotan nga software sa kompyuter, nga makatabang sa pagpili sa template.Ang mga resulta sa eksperimento nagpakita nga ang pagpalapad kasagaran dili molampos kung ang libre nga enerhiya (△G) sa rehiyon nga palapdan kay ubos pa sa 58.6lkJ/mol.
5. Dili tugma sa target nga DNA
Kung ang gipadako nga target nga DNA sequence dako, ang usa ka primer mahimong magbugkos sa daghang mga bahin sa target nga DNA, nga moresulta sa daghang mga banda nga makita sa resulta.Niining higayona gikinahanglan nga gamiton ang BLAST software testing, website:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Pilia ang Align two sequences (bl2seq).
Ang pag-paste sa mga primer sequence ngadto sa zone 1 ug ang target nga DNA sequence ngadto sa zone 2 kay mabaylo, ug ang BLAST nagkalkula sa complementary, antisense, ug uban pang mga posibilidad, mao nga ang mga tiggamitan dili kinahanglan nga makamatikod kon ang duha ka kadena mga sense chain.Mahimo ka usab nga mosulod sa numero sa GI kung nahibal-an nimo ang numero sa GI sa pagkasunod-sunod sa database, aron dili nimo kinahanglan nga idikit ang usa ka dako nga seksyon sa pagkasunod-sunod.Sa katapusan, i-klik ang Align sa 3 aron makita kung ang primer adunay daghang homologous nga mga site sa target nga DNA.
6. Panguna nga terminal
Ang 3 'katapusan sa primer kung diin nagsugod ang extension, busa hinungdanon nga mapugngan ang mga dili managsama nga pagsugod didto.Ang 3 'katapusan kinahanglan nga dili labaw pa sa 3 nga sunod-sunod nga G o C, tungod kay kini ang hinungdan sa primer nga sayop nga ma-trigger sa G+C enrichment sequence nga rehiyon.Ang 3 'katapusan dili makahimo sa bisan unsang sekondaryang istruktura, gawas sa espesyal nga PCR (AS-PCR) nga mga reaksyon, ang 3' nga tumoy sa primer dili mahimong dili magkatakdo.Pananglitan, kung ang rehiyon sa pag-encode gipalapad, ang 3 'katapusan sa primer kinahanglan dili tapuson sa ikatulo nga posisyon sa codon, tungod kay ang ikatulo nga posisyon sa codon dali nga madaot, nga makaapekto sa espesipiko ug kahusayan sa pagpadako.Kung mogamit ug annexation primers, tan-awa ang codon use table, pagtagad sa biological preference, ayaw gamita ang annexation primers sa 3′ end, ug gamita ang mas taas nga konsentrasyon sa primers (1uM-3uM).
7. Ikaduha nga istruktura sa mga primer
Ang mga primer mismo dili kinahanglan nga adunay mga complementary sequence, kung dili ang mga primer mismo mapilo sa mga istruktura sa hairpin, ug kini nga sekundaryong istruktura makaapekto sa pagbugkos sa mga primer ug templates tungod sa steric hindrance.Kung gigamit ang artipisyal nga paghukom, ang padayon nga komplementaryong base sa mga primer mismo kinahanglan dili molapas sa 3bp.Kinahanglang walay komplementaridad tali sa duha ka primer, ilabina ang komplementaryong pagsapaw sa 3 'katapusan kinahanglan likayan aron mapugngan ang pagporma sa primer dimer.Sa kinatibuk-an, kinahanglan nga adunay dili molapas sa 4 nga sunud-sunod nga base homology o complementarity tali sa usa ka parisan sa mga primer.
8. Idugang ang mga marker o loci
Ang 5 'katapusan adunay gamay nga epekto sa espesipiko sa pagpadako ug busa mahimo’g mabag-o nga wala makaapekto sa espesipiko sa amplification.Ang kausaban sa primer 5 'katapusan naglakip sa: pagdugang enzyme restriction site;Gimarkahan nga biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, ug uban pa. Ipaila ang mga sequence sa DNA nga nagbugkos sa protina;Ang pagpaila sa mga mutation site, pagsal-ot ug pagkawala sa mutation sequence ug pagpaila sa promoter sequence, ug uban pa.Ang dugang nga mga han-ay nga wala maglungtad sa target nga han-ay, sama sa mga restriction site ug promoter sequence, mahimong idugang sa 5′ nga katapusan sa primer nga dili makaapekto sa espesipiko.Kini nga mga han-ay wala gilakip sa kalkulasyon sa primer Tm nga mga kantidad, apan kinahanglan nga sulayan alang sa komplementaridad ug internal nga sekondaryang istruktura.
9. Mga subclone
Kasagaran, ang PCR usa lamang ka preliminary cloning, ug unya kinahanglan naton nga i-subclone ang target nga tipik sa lainlaing mga vector, mao nga kinahanglan naton nga magdesinyo og dugang nga mga base alang sa sunod nga operasyon sa lakang sa PCR.
Ang pipila ka mga han-ay nga gidisenyo alang sa subcloning gi-summarize sa ubos.
Ang restriction endonuclease restriction site gidugang
Ang pagdugang sa mga site sa pagdili sa enzyme mao ang kasagarang gigamit nga pamaagi sa pag-subcloning sa mga produkto sa PCR.Kasagaran, ang cleavage site mao ang unom ka mga base, dugang pa sa 5 'katapusan sa cleavage site kinahanglan nga makadugang 2 ~ 3 protective base.Bisan pa, ang gidaghanon sa mga proteksiyon nga base nga gikinahanglan sa lainlaing mga enzyme lahi.Pananglitan, ang SalⅠ wala magkinahanglan og protective base, EcoRⅤ nagkinahanglan og 1 protective base, DiliⅠ nagkinahanglan og 2 protective base, ug Hind Ⅲ nagkinahanglan og 3 protective base.
Gidugang sa LIC ang ikog
Ang tibuok nga ngalan sa LIC kay Ligation-Independent cloning, usa ka cloning nga pamaagi nga giimbento ni Navogen ilabi na sa bahin niini sa pET vector.Ang pET carrier nga giandam pinaagi sa LIC nga pamaagi adunay non-commplementary 12-15 base single strand sticky ends, nga nag-complement sa katumbas nga sticky ends sa target insert fragment.Alang sa mga katuyoan sa pagpadako, ang primer 5′ nga pagkasunod-sunod sa gisulud nga tipik kinahanglan nga komplemento sa LIC vector.Ang 3′→5′ extranect nga kalihokan sa T4 DNA polymerase mahimong usa ka strand nga sticky end sa gisulod nga tipik human sa mubo nga panahon.Tungod kay ang produkto mahimo lamang nga maporma gikan sa mutual annealing sa giandam nga insert fragment ug ang vector, kini nga pamaagi paspas ug episyente, ug kini gitumong sa pag-clone.
Gimandoan ang TA clone pagdugang ikog
Ang TA cloning wala makahimo sa pag-target sa fragment ngadto sa usa ka vector, mao nga sa ulahi ang Invitrogen nagpaila sa usa ka vector nga mahimong target cloning, nga adunay upat ka prominenteng base GTGGS sa usa ka tumoy.Busa, sa disenyo sa mga primer sa PCR, ang mga komplementaryong han-ay kinahanglan nga idugang sumala niana, aron ang mga tipik mahimong "oriented".
Kung kulang ka sa oras, mahimo nimong sulayan ang direkta nga synthesis, paghiusa sa gene sa vector, nga gitawag namon nga ET gene synthesis sa mga musecularist.
D. In-Fusion cloning nga pamaagi
Walay ligase nga gikinahanglan, walay dugay nga reaksyon nga gikinahanglan.Hangtud nga ang usa ka han-ay sa duha ka tumoy sa linearized vector gipaila Sa disenyo sa mga primer, nan ang produkto sa PCR ug ang linearized nga vector idugang ngadto sa in-fusion nga enzyme nga solusyon nga adunay BSA ug ibutang sa temperatura sa lawak sulod sa tunga sa oras, ang pagbag-o mahimong ipahigayon.Kini nga pamaagi labi ka angay alang sa daghang pagbag-o sa volume.
10. Paghiusa sa primer
Usahay, limitado ra ang kasayuran sa pagkasunod-sunod ang nahibal-an bahin sa disenyo sa primer.Pananglitan, kung nahibal-an lamang ang han-ay sa amino acid, ang paghiusa nga primer mahimong madisenyo.Ang usa ka merger primer usa ka sinagol nga lain-laing mga han-ay nga nagrepresentar sa tanan nga lain-laing base nga mga posibilidad nga nag-encode sa usa ka amino acid.Aron madugangan ang espesipiko, mahimo nimong i-refer ang lamesa sa paggamit sa codon aron makunhuran ang annexation sumala sa gusto sa base nga paggamit sa lainlaing mga organismo.Ang hypoxanthine mahimong ipares sa tanan nga mga base aron makunhuran ang temperatura sa annealing sa primer.Ayaw gamita ang annexed base sa 3′ end sa primer tungod kay ang annealing sa katapusang 3 base sa 3′ end igo na aron masugdan ang PCR sa sayop nga site.Ang mas taas nga primerong konsentrasyon (1μM ngadto sa 3μM) gigamit tungod kay ang mga primer sa daghang annexation mixtures dili espesipiko sa target template.
PCR hilaw nga materyaleskontrol
1. Primer nga gidaghanon
Ang konsentrasyon sa matag primer mao ang 0.1 ~ 1umol o 10 ~ 100pmol.Mas maayo ang paghimo sa gikinahanglan nga resulta nga adunay labing ubos nga kantidad sa primer.Ang taas nga konsentrasyon sa primer magpahinabog mismatch ug non-specific amplification, ug madugangan ang kahigayonan nga maporma ang mga dimer tali sa mga primer.
2. Panguna nga konsentrasyon
Ang konsentrasyon sa mga primera makaapekto sa espesipiko.Ang kamalaumon nga konsentrasyon sa primer kasagaran tali sa 0.1 ug 0.5μM.Ang mas taas nga mga konsentrasyon sa primer nagdala ngadto sa pagpadako sa dili piho nga mga produkto.
3. Annealing temperatura sa primer
Ang laing importante nga parameter alang sa mga primer mao ang temperatura sa pagtunaw (Tm).Kini ang temperatura kung ang 50% sa mga primer ug komplementaryong mga han-ay girepresentahan isip double-stranded nga mga molekula sa DNA.Gikinahanglan ang Tm sa pagtakda sa PCR annealing temperature.Sa tinuud, ang temperatura sa annealing igo nga ubos aron masiguro ang epektibo nga pag-annealing sa mga primer nga adunay target nga han-ay, apan igo nga taas aron makunhuran ang dili piho nga pagbugkos.Makatarunganon annealing temperatura gikan sa 55 ℃ ngadto sa 70 ℃.Ang temperatura sa pag-anne sa kasagaran gitakda nga 5 ℃ mas ubos kaysa Tm sa primer.
Adunay ubay-ubay nga mga pormula alang sa pagtakda sa Tm, nga magkalainlain kaayo depende sa pormula nga gigamit ug ang pagkasunod-sunod sa mga primer.Tungod kay ang kadaghanan sa mga pormula naghatag og gibanabana nga Tm nga kantidad, ang tanan nga mga temperatura sa pag-anil usa lamang ka punto sa pagsugod.Ang espesipiko mahimong mapauswag pinaagi sa pag-analisar sa daghang mga reaksyon nga anam-anam nga nagpataas sa temperatura sa annealing.Pagsugod sa ubos sa gibanabana nga Tm-5 ℃, ug hinayhinay nga dugangan ang temperatura sa annealing sa usa ka pagtaas sa 2 ℃.Ang mas taas nga temperatura sa annealing makapakunhod sa pagporma sa mga primer dimer ug dili piho nga mga produkto.Alang sa labing maayo nga mga resulta, ang duha nga mga primer kinahanglan adunay gibanabana nga mga kantidad sa Tm.Kung ang kalainan sa Tm sa mga pares sa primer labi pa sa 5 ℃, ang mga primer magpakita usa ka hinungdanon nga sayup nga pagsugod pinaagi sa paggamit sa usa ka mas ubos nga temperatura sa annealing sa siklo.Kung ang duha ka primera Tm managlahi, itakda ang annealing temperature ngadto sa 5 ℃ ubos sa pinakaubos nga Tm.Sa laing paagi, aron madugangan ang espesipiko, lima ka mga siklo ang mahimo una sa mga temperatura sa annealing nga gidisenyo alang sa mas taas nga Tm, gisundan sa nahabilin nga mga siklo sa mga temperatura sa annealing nga gidisenyo alang sa mas ubos nga Tm.Kini nagtugot sa usa ka partial nga kopya sa destinasyon nga template nga makuha ubos sa hugot nga mga kondisyon.
4. Panguna nga kaputli ug kalig-on
Ang sukaranan nga kaputli sa naandan nga mga primer igo na alang sa kadaghanan sa mga aplikasyon sa PCR.Ang pagtangtang sa benzoyl ug isobutylyl nga mga grupo pinaagi sa desalting gamay ra ug busa dili makabalda sa PCR.Ang ubang mga aplikasyon nanginahanglan pagputli aron matangtang ang bisan unsang dili bug-os nga mga han-ay sa proseso sa synthesis.Kini nga naputol nga mga han-ay mahitabo tungod kay ang kaepektibo sa DNA synthesis chemistry dili 100%.Kini usa ka lingin nga proseso nga naggamit sa balik-balik nga kemikal nga mga reaksyon samtang ang matag base gidugang aron mahimo ang DNA gikan sa 3′ hangtod 5′.Mahimo kang mapakyas sa bisan asa nga siklo.Ang mas taas nga mga primer, ilabi na kadtong labaw pa sa 50 ka base, adunay dako nga proporsiyon sa naputol nga mga han-ay ug mahimong magkinahanglan og pagputli.
Ang abot sa mga primera apektado sa kaepektibo sa sintetikong chemistry ug pamaagi sa pagputli.Ang mga kompanya sa biopharmaceutical, sama sa Cytology ug Shengong, tanan naggamit sa usa ka minimum nga yunit sa OD aron masiguro ang kinatibuk-ang output sa oligonucleoside.Ang mga custom nga primer gipadala sa dry powder nga porma.Labing maayo nga i-redissolve ang mga primer sa TE aron ang katapusan nga konsentrasyon mao ang 100μM.Ang TE mas maayo kay sa deionized nga tubig tungod kay ang pH sa tubig kasagaran acidic ug maoy hinungdan sa hydrolysis sa oligonucleosides.
Ang kalig-on sa mga primer nagdepende sa mga kondisyon sa pagtipig.Ang uga nga powder ug dissolved primers kinahanglan nga tipigan sa -20 ℃.Ang mga primer nga natunaw sa TE sa mga konsentrasyon nga labaw sa 10μM mahimong lig-on nga gitipigan sa -20 ℃ sulod sa 6 ka bulan, apan mahimo lamang nga tipigan sa temperatura sa lawak (15 ℃ ngadto sa 30 ℃) sulod sa ubos sa 1 ka semana.Ang mga dry powder primer mahimong tipigan sa -20 C sulod sa labing menos 1 ka tuig ug sa temperatura sa kwarto (15 C hangtod 30 C) hangtod sa 2 ka bulan.
5. Enzymes ug ang ilang mga konsentrasyon
Sa pagkakaron, ang Taq DNA polymerase nga gigamit mao ang gene engineering enzyme nga gi-synthesize sa coliform bacteria.Ang gidaghanon sa enzyme nga gikinahanglan sa pag-catalyze sa usa ka tipikal nga reaksyon sa PCR maoy mga 2.5U(nagtumong sa kinatibuk-ang gidaghanon sa reaksyon nga 100ul).Kung ang konsentrasyon taas kaayo, kini mahimong mosangpot sa dili piho nga pagpadako;kung ang konsentrasyon gamay ra, ang kantidad sa sintetikong produkto makunhuran.
6. Kalidad ug konsentrasyon sa dNTP
Ang kalidad sa dNTP suod nga nalangkit sa konsentrasyon ug sa kahusayan sa PCR amplification.Ang dNTP powder kay granular, ug ang pagkausab niini mawad-an sa iyang biolohikal nga kalihokan kon kini dili husto nga gitipigan.Ang solusyon sa dNTP acidic, ug kinahanglan gamiton sa taas nga konsentrasyon, nga adunay 1M NaOH o 1M Tris.HCL buffer solution aron ma-adjust ang PH niini sa 7.0 ~ 7.5, gamay nga kantidad sa sub-packaging, frozen nga pagtipig sa -20 ℃.Ang daghang pag-freeze-thawing makadaut sa dNTP.Sa reaksyon sa PCR, ang dNTP kinahanglan nga 50 ~ 200umol/L.Ilabi na, ang pagtagad kinahanglan ibayad sa konsentrasyon sa upat ka DNTPS kinahanglan nga managsama (parehas nga pag-andam sa mole).Kung ang konsentrasyon sa bisan kinsa sa kanila lahi sa uban (mas taas o mas ubos), ang mismatch mahimong hinungdan.Ang ubos kaayo nga konsentrasyon makapakunhod sa abot sa mga produkto sa PCR.Ang dNTP mahimong maghiusa sa Mg2+ ug makunhuran ang konsentrasyon sa libre nga Mg2+.
7. Template (target gene) nucleic acid
Ang kantidad ug ang-ang sa pagputli sa template nucleic acid mao ang usa sa mga yawe nga link alang sa kalampusan o kapakyasan sa PCR.Ang tradisyonal nga mga pamaagi sa pagputli sa DNA kasagarang naggamit sa SDS ug protease K sa paghilis ug paglabay sa mga espesimen.Ang nag-unang mga gimbuhaton sa SDS mao ang: dissolve lipids ug protina sa cell lamad, sa ingon paglaglag sa cell lamad pinaagi sa dissolving lamad protina, ug dissociate nukleyar protina sa cell, SDS mahimo usab combine uban sa protina ug precipitate;Ang Protease K mahimong mag-hydrolyze ug makahilis sa mga protina, ilabina ang mga histones nga gigapos sa DNA, ug unya mogamit sa organic solvent phenol ug chloroform sa pagkuha sa mga protina ug uban pang mga sangkap sa selula, ug mogamit sa ethanol o isopropyl alcohol aron sa pag-precipitate sa nucleic acid.Ang gikuha nga nucleic acid mahimong gamiton isip template sa mga reaksiyon sa PCR.Para sa kinatibuk-ang clinical detection nga mga specimen, ang usa ka dali ug yano nga pamaagi mahimong gamiton sa pagtunaw sa mga selula, lysate pathogens, paghilis ug pagtangtang sa mga protina gikan sa mga chromosome ngadto sa libre nga target nga mga gene, ug direkta nga gamiton alang sa PCR amplification.Ang RNA template extraction kasagarang naggamit sa guanidine isothiocyanate o protease K nga pamaagi aron mapugngan ang RNase sa pagdaot sa RNA.
8.Mg2+ konsentrasyon
Ang Mg2+ adunay dakong epekto sa espesipiko ug abot sa PCR amplification.Sa kinatibuk-ang reaksyon sa PCR, kung ang konsentrasyon sa lainlaing dNTP 200umol/L, ang angay nga konsentrasyon sa Mg2+ mao ang 1.5 ~ 2.0mmol/L.Ang konsentrasyon sa Mg2 + kay taas kaayo, ang reaksyon nga espesipiko mikunhod, ang dili piho nga pagpadako mahitabo, ang ubos kaayo nga konsentrasyon makapakunhod sa kalihokan sa Taq DNA polymerase, nga moresulta sa pagkunhod sa mga produkto sa reaksyon.
Magnesium ions makaapekto sa pipila ka mga aspeto sa PCR, sama sa DNA polymerase nga kalihokan, nga makaapekto sa abot;Ang laing pananglitan mao ang primer annealing, nga makaapekto sa espesipiko.Ang dNTP ug template nagbugkos sa magnesium ion, nga nagpamenos sa gidaghanon sa libre nga magnesium ion nga gikinahanglan alang sa kalihokan sa enzyme.Ang labing maayo nga konsentrasyon sa magnesium ion magkalainlain alang sa lainlaing mga pares sa primer ug mga template, apan ang kasagaran nga konsentrasyon sa pagsugod sa PCR nga adunay 200μM dNTP mao ang 1.5mM (pahinumdom: Alang sa tinuud nga oras nga quantitative PCR, gamita ang 3 hangtod 5mM nga solusyon sa magnesium ion nga adunay fluorescent probe).Ang mas taas nga konsentrasyon sa mga libre nga magnesium ion nagdugang sa ani, apan nagdugang usab sa dili piho nga pagpadako ug pagkunhod sa pagkamatinud-anon.Aron mahibal-an ang kamalaumon nga konsentrasyon, ang mga titration sa magnesium ion gihimo sa mga pagtaas sa 0.5mM gikan sa 1mM hangtod 3mM.Aron makunhuran ang pagsalig sa pag-optimize sa magnesium ion, mahimong magamit ang Platinum Taq DNA polymerase.Ang Platinum Taq DNA polymerase makahimo sa pagpadayon sa pag-obra sa mas lapad nga mga konsentrasyon sa magnesium ion kaysa sa Taq DNA polymerase ug busa nanginahanglan gamay nga pag-optimize.
9. Pcr-promoting additives
Ang pag-optimize sa temperatura sa annealing, disenyo sa primer, ug konsentrasyon sa magnesium ion igo na alang sa labi ka piho nga pagpadako sa kadaghanan nga mga template;bisan pa, pipila ka mga template, lakip ang adunay taas nga sulud sa GC, nanginahanglan dugang nga mga lakang.Ang mga additives nga makaapektar sa temperatura sa pagkatunaw sa DNA naghatag ug laing paagi aron mapalambo ang espesipiko ug abot sa produkto.Ang bug-os nga denaturation sa template gikinahanglan alang sa labing maayo nga mga resulta.
Dugang pa, ang sekondaryang istruktura nagpugong sa pagbugkos sa primer ug pagpalapad sa enzyme.
Ang mga additives sa PCR, lakip ang formamide, DMSO, glycerin, betaine, ug PCRx Enhancer Solution, makapauswag sa amplification.Ang ilang posible nga mekanismo mao ang pagpakunhod sa temperatura sa pagkatunaw, sa ingon nagtabang sa pag-annealing sa mga primer ug pagtabang sa pagpalapad sa DNA polymerase pinaagi sa rehiyon sa sekondaryang istruktura.Ang PCRx Solution adunay ubang mga bentaha.Ang minimum nga pag-optimize sa magnesium ion gikinahanglan kung gamiton sa Platinum Taq DNA polymerase ug Platinum Pfx DNA polymerase.Sa ingon, ang Platinum nga teknik gihiusa sa additive aron madugangan ang espesipiko samtang gikunhuran ang pagsalig sa ikatulo nga pamaagi, ang pag-optimize sa magnesium ion.Alang sa labing kaayo nga mga sangputanan, ang konsentrasyon sa mga additives kinahanglan nga ma-optimize, labi na ang DMSO, formamide, ug glycerol, nga nagpugong sa Taq DNA polymerase.
10. Mainit nga pagsugod
Ang init nga pagsugod sa PCR maoy usa sa pinakaimportante nga pamaagi aron mapalambo ang espesipiko sa PCR dugang pa sa maayong primerong disenyo.Bisan kung ang labing maayo nga elongation nga temperatura sa Taq DNA polymerase mao ang 72 ℃, ang polymerase nagpabilin nga aktibo sa temperatura sa kwarto.Sa ingon, ang dili piho nga mga produkto gihimo kung ang temperatura sa pagpugong mas ubos kaysa sa temperatura sa annealing sa panahon sa pag-andam sa reaksyon sa PCR ug sa pagsugod sa thermal cycle.Sa higayon nga maporma, kini nga mga nonspecific nga mga produkto epektibo nga gipadako.Ang hot-start nga PCR ilabinang epektibo kung ang mga site nga gigamit alang sa primerong disenyo limitado sa lokasyon sa genetic nga mga elemento, sama sa site-directed mutations, expression cloning, o pagtukod ug pagmaniobra sa genetic nga mga elemento nga gigamit alang sa DNA engineering.
Usa ka kasagarang paagi aron limitahan ang kalihokan sa Taq DNA polymerase mao ang pag-andam sa PCR reaction solution sa yelo ug ibutang kini sa preheated PCR apparatus.Kini nga pamaagi yano ug dili mahal, apan dili kini makompleto ang kalihokan sa enzyme ug busa dili hingpit nga mawala ang pagpadako sa dili piho nga mga produkto.
Ang thermal priming naglangan sa DNA synthesis pinaagi sa pagpugong sa usa ka hinungdanon nga sangkap hangtod ang PCR apparatus makaabut sa temperatura sa denaturation.Kadaghanan sa mga manual nga pamaagi sa pagsugod sa thermal, lakip ang nalangan nga pagdugang sa Taq DNA polymerase, lisud, labi na alang sa mga aplikasyon nga high-throughput.Ang ubang mga pamaagi sa thermal priming naggamit ug wax shield aron ilakip ang usa ka importanteng component, lakip ang magnesium ions o enzymes, o sa pisikal nga pag-isolate sa mga reactive component, sama sa templates ug buffers.Atol sa thermal cycle, ang lainlaing mga sangkap gipagawas ug gisagol samtang ang talo natunaw.Sama sa manual hot start method, ang wax shield nga pamaagi kay hago ug prone sa kontaminasyon ug dili angay para sa high throughput applications.
Ang platinum DNA polymerase kombenyente ug episyente alang sa awtomatikong init nga pagsugod sa PCR.Ang Platinum Taq DNA polymerase naglangkob sa recombinant nga Taq DNA polymerase nga gihiusa sa monoclonal antibody batok sa Taq DNA polymerase.Ang mga antibodies giporma sa PCR aron mapugngan ang kalihokan sa enzyme sa panahon sa dugay nga pagpugong sa temperatura.Ang Taq DNA polymerase gipagawas sa reaksyon sa panahon sa 94 ℃ insulasyon sa lakang sa denaturation, nga nagpahiuli sa tibuuk nga kalihokan sa polymerase.Sukwahi sa chemically modified Taq DNA polymerase para sa thermal initiation, ang Platinum enzyme wala magkinahanglan ug dugay nga insulasyon sa 94 ℃ (10 ngadto sa 15 minutos) aron ma-activate ang polymerase.Uban sa PlatinumTaq DNA polymerase, 90% sa Taq DNA polymerase nga kalihokan gipahiuli pagkahuman sa 2 minuto sa 94 ℃.
11. Salag-PCR
Ang sunud-sunod nga mga round sa amplification gamit ang nested primers makapauswag sa specificity ug sensitivity.Ang una nga hugna usa ka sagad nga pagpadako sa 15 hangtod 20 nga mga siklo.Usa ka gamay nga bahin sa inisyal nga produkto sa amplification ang lasaw 100 hangtod 1000 ka beses ug gidugang sa ikaduhang hugna sa amplification alang sa 15 hangtod 20 nga mga siklo.Sa laing paagi, ang inisyal nga gipadako nga produkto mahimong masukod pinaagi sa pagputli sa gel.Ang usa ka nested primer gigamit sa ikaduhang hugna sa amplification, nga makagapos sa target sequence sulod sa unang primer.Ang paggamit sa nested PCR makapakunhod sa posibilidad sa pagpadako sa daghang target nga mga site tungod kay adunay pipila ka target nga han-ay nga komplementaryo sa duha ka set sa mga primer.Ang parehas nga kinatibuk-ang gidaghanon sa mga siklo (30 hangtod 40) nga adunay parehas nga mga primer nagpadako sa dili piho nga mga lugar.Ang nested PCR nagdugang sa pagkasensitibo sa limitado nga target nga han-ay (pananglitan, talagsaon nga mrnas) ug nagpalambo sa espesipiko sa lisud nga PCRS (eg 5′ RACE).
12. Pagpaubos sa PCR
Ang pagkanaog sa PCR nagpauswag sa espesipiko pinaagi sa paggamit sa hugot nga mga kondisyon sa annealing alang sa unang pipila ka mga siklo sa PCR.Ang cycle magsugod sa usa ka annealing temperatura gibana-bana nga 5 ℃ mas taas kay sa gibanabana nga Tm, unya ang matag cycle mao ang pagkunhod sa 1 ℃ ngadto sa 2 ℃ hangtud nga ang annealing temperatura ubos sa Tm 5 ℃.Ang destinasyon lamang nga template nga adunay pinakataas nga homology ang mapadako.Kini nga mga produkto nagpadayon sa pagpalapad sa sunod-sunod nga mga siklo, nga naghuot sa mga gipadako nga dili piho nga mga produkto.Ang pagpaubos sa PCR mapuslanon alang sa mga pamaagi diin ang lebel sa homology tali sa primer ug target nga template wala mahibal-an, sama sa AFLP DNA fingerprinting.
May Kalabutan nga mga PCR Kit
Ang 2 × PCR HeroTMAng mix system adunay mas taas nga tolerance sa PCR inhibitors kay sa ordinaryo nga PCR Mix system, ug daling makasagubang sa PCR amplification sa nagkalain-laing komplikadong templates.Ang talagsaon nga sistema sa reaksyon ug taas nga episyente nga Taq Hero naghimo sa reaksyon sa PCR nga adunay mas taas nga kahusayan sa amplification, espesipiko ug pagkasensitibo.
Mas taas nga amplification efficiency
Kini adunay 5'→3' DNA polymerase activity ug 5'→3' exonuclease activity, walay 3'→5' exonuclease activity.
Tinuod nga Oras nga PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Ang piho nga-optimized nga buffer ug init nga pagsugod nga Taq enzyme makapugong sa dili piho nga pagpadako ug pagporma sa primer dimer
Taas nga pagkasensitibo—makamatikod sa ubos nga mga kopya sa template
RT-PCR Easyᵀᴹ I(Usa ka Lakang)
Ang kit naggamit sa usa ka talagsaon nga Foregene reverse transcription reagent ug Foregene HotStar Taq DNA Polymerase nga gihiusa uban sa usa ka talagsaon nga sistema sa reaksyon aron epektibong mapausbaw ang episyente sa amplification ug espesipiko sa reaksyon.
Oras sa pag-post: Mayo-09-2023
