Walay amplification signal

1. Ang Taq DNA Polymerase sa kit mawad-an sa kalihokan niini tungod sa dili husto nga pagtipig o pag-expire sa kit.
Rekomendasyon: Kumpirma ang mga kondisyon sa pagtipig sa kit;idugang pag-usab ang angay nga kantidad sa Taq DNA Polymerase sa PCR system o pagpalit ug bag-ong Real Time PCR Kit para sa mga may kalabotan nga eksperimento.

2.Adunay daghang mga inhibitor sa Taq DNA Polymerase sa DNA template.
Sugyot: Pagputli sa template o pagpakunhod sa gidaghanon sa template nga gigamit.

3.Ang konsentrasyon sa Mg2+ dili angay.
Rekomendasyon: Ang konsentrasyon sa Mg2+ sa 2 × Tinuod nga PCR Mix nga among gihatag mao ang 3.5mM.Bisan pa, alang sa pipila ka espesyal nga mga primer ug template, ang konsentrasyon sa Mg2+ mahimong mas taas.Busa, mahimo nimong direktang idugang ang MgCl2 aron ma-optimize ang konsentrasyon sa Mg2+.Girekomenda nga dugangan ang Mg2+ 0.5mM matag higayon alang sa pag-optimize.

4. Ang PCR amplification nga mga kondisyon dili angay, ug ang primer sequence o konsentrasyon dili husto.
Sugyot: kumpirmahi ang pagkahusto sa primer sequence ug ang primer wala madaot;kung dili maayo ang signal sa amplification, paningkamuti nga ipaubos ang temperatura sa annealing ug i-adjust ang primer nga konsentrasyon sa tukmang paagi.

5.Ang kantidad sa template gamay ra o sobra ra kaayo.
Rekomendasyon: Buhata ang template linearization gradient dilution, ug pilia ang template concentration nga adunay labing maayo nga PCR effect para sa Real Time PCR experiment.

Ang NTC adunay taas kaayo nga fluorescence value

1.Reagent kontaminasyon tungod sa panahon sa operasyon.
Rekomendasyon: Ilisan ug bag-ong mga reagents para sa Real Time PCR experiments.

2. Ang kontaminasyon nahitabo sa panahon sa pag-andam sa PCR reaction system.
Rekomendasyon: Buhata ang gikinahanglan nga mga paagi sa pagpanalipod sa panahon sa operasyon, sama sa: pagsul-ob sa latex nga gwantes, paggamit sa tip sa pipette nga adunay filter, ug uban pa.

3.Ang mga primera nadaot, ug ang pagkadaot sa mga primera maoy hinungdan sa dili piho nga pagpadako.
Sugyot: Gamita ang SDS-PAGE electrophoresis aron mahibal-an kung ang mga primer nadaot, ug pulihan kini og bag-ong mga primer para sa Real Time PCR nga mga eksperimento.

Primer dimer o dili piho nga pagpadako

1.Ang konsentrasyon sa Mg2+ dili angay.
Rekomendasyon: Ang konsentrasyon sa Mg2+ sa 2× Real PCR EasyTM Mix nga among gihatag mao ang 3.5 mM.Bisan pa, alang sa pipila ka espesyal nga mga primer ug template, ang konsentrasyon sa Mg2+ mahimong mas taas.Busa, mahimo nimong direktang idugang ang MgCl2 aron ma-optimize ang konsentrasyon sa Mg2+.Girekomenda nga dugangan ang Mg2+ 0.5mM matag higayon alang sa pag-optimize.

2.Ang PCR annealing temperatura ubos kaayo.
Sugyot: Dugangi ang PCR annealing temperature sa 1 ℃ o 2 ℃ matag higayon.

3. Ang produkto sa PCR taas kaayo.
Rekomendasyon: Ang gitas-on sa produkto sa Real Time PCR kinahanglang tali sa 100-150bp, dili molapas sa 500bp.

4.Ang mga primera nadaot, ug ang pagkadaot sa mga primera mosangpot sa dagway sa espesipikong pagpadako.
Sugyot: Gamita ang SDS-PAGE electrophoresis aron mahibal-an kung ang mga primer nadaot, ug pulihan kini og bag-ong mga primer para sa Real Time PCR nga mga eksperimento.

5. Ang sistema sa PCR dili husto, o ang sistema gamay ra kaayo.
Sugyot: Ang sistema sa reaksyon sa PCR gamay ra kaayo hinungdan nga mokunhod ang katukma sa pagkakita.Labing maayo nga gamiton ang sistema sa reaksyon nga girekomenda sa quantitative nga instrumento sa PCR aron mabalik ang eksperimento sa Real Time PCR.

Dili maayo nga pagsubli sa quantitative values

1. Ang instrumento nagdaot.
Sugyot: Mahimong adunay mga kasaypanan tali sa matag PCR hole sa instrumento, nga moresulta sa dili maayo nga reproducibility sa panahon sa pagdumala sa temperatura o detection.Palihug susiha sumala sa mga instruksyon sa katugbang nga instrumento.

2.Ang sample nga kaputli dili maayo.
Rekomendasyon: Ang dili putli nga mga sampol motultol sa dili maayo nga reproducibility sa eksperimento, nga naglakip sa kaputli sa template ug mga primer.Labing maayo nga limpyohan pag-usab ang template, ug ang mga primer labing maayo nga giputli pinaagi sa SDS-PAGE.

3.Ang pag-andam sa sistema sa PCR ug oras sa pagtipig taas kaayo.
Sugyot: Gamita ang Sistema sa Real Time PCR para sa eksperimento sa PCR diha-diha dayon human sa pagpangandam, ug ayaw kini ibilin ug dugay.

4. Ang PCR amplification nga mga kondisyon dili angay, ug ang primer sequence o konsentrasyon dili husto.
Sugyot: kumpirmahi ang pagkahusto sa primer sequence ug ang primer wala madaot;kung dili maayo ang signal sa amplification, paningkamuti nga ipaubos ang temperatura sa annealing ug i-adjust ang primer nga konsentrasyon sa tukmang paagi.

5. Ang sistema sa PCR dili husto, o ang sistema gamay ra kaayo.
Sugyot: Ang sistema sa reaksyon sa PCR gamay ra kaayo hinungdan nga mokunhod ang katukma sa pagkakita.Labing maayo nga gamiton ang sistema sa reaksyon nga girekomenda sa quantitative nga instrumento sa PCR aron mabalik ang eksperimento sa Real Time PCR.