Ang eksperimento sa RT-qPCR naglakip sa RNA extraction ug quality assessment, reverse transcription ug qPCR tulo ka mga lakang, ang matag lakang adunay daghang mga pag-amping, atong ipaila sa detalye sa ubos.

Ⅰ.Pagsusi sa kalidad sa RNA

Sa eksperimento sa RT-qPCR, pagkahuman sa pagkompleto sa pagkuha sa RNA, kinahanglan nga susihon ang kalidad sa RNA, ug ang pag-follow-up nga eksperimento mahimo ra pagkahuman kung kini kwalipikado.Ang mga pamaagi sa pagtimbang-timbang naglakip sa spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 nga pagtuki, diin ang labing kasagarang gigamit nga spectrophotometer ug agarose gel electrophoresis nga pamaagi sa pagkakita.Kini kinahanglan nga matikdan nga kining duha ka mga pamaagi kinahanglan nga gamiton sa tingub aron sa pagkompleto sa detection ug pagtuki sa RNA konsentrasyon, kaputli ug integridad, aron sa pagsiguro sa kalidad sa RNA.

May Kalabutan nga RNA Isolation Kit: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Ang labi ka putli ug taas nga kalidad nga kinatibuk-ang RNA mahimong makuha gikan sa lainlaing mga kultura nga mga selula sa 11min.

Animal Total RNA Isolation Kit

Dali ug episyente nga makuha ang taas nga kaputli ug taas nga kalidad nga kinatibuk-ang RNA gikan sa lainlaing mga tisyu sa hayop.

Spectrophotometer:

Ang spectrophotometer gigamit sa pagtino sa konsentrasyon ug kaputli sa RNA, apan dili kini makamatikod sa integridad sa RNA ug genomic residue.Lakip kanila, A260/280 ug A260/230 mao ang importante nga mga parameter alang sa RNA purity detection, ug RNA kaputli mahimong mamatikdan sumala sa pag-usab-usab sa ilang mga bili:

1. 1.9< A260/280< 2.1, nga nagpakita nga ang RNA kaputli maayo;A260/280<1.9, nga nagpakita nga mahimong adunay protina nga nahabilin sa RNA;A260 / 280> 2.1, nga nagpaila sa posible nga partial degradation sa RNA, nga mahimong dugang nga makumpirma pinaagi sa agarose gel electrophoresis.

2. 2.0< A260/230< 2.2, nga nagpakita nga ang RNA kaputli maayo;A260/230< 2.0, nga nagpakita nga adunay mga nahabilin sa mga organikong reagents sa RNA, sama sa phenols, ethanol o sugars.

Agarose gel electrophoresis:

Ang agarose gel electrophoresis assay mahimong mag-analisar sa integridad sa RNA, genome ug mga residu sa protina, apan dili tukma nga maihap ang konsentrasyon sa RNA o makit-an ang mga nahabilin sa mga organikong reagents.Dad-a pananglitan ang eukaryotic RNA templates:

1. Ang RNA gipailalom sa agarose gel electrophoresis.Kung adunay tulo ra ka usa ka banda sa 28sRNA, 18sRNA ug 5.8sRNA sa mapa sa gel, kini nagpakita nga ang nakuha nga RNA wala’y labot.Kung adunay usa ka pag-drag nga panghitabo, kini nagpakita sa partial degradation sa RNA.

2. Kung adunay usa ka hayag nga banda tali sa glue hole ug sa 28sRNA band, mahimong adunay genomic DNA residue.

3. Kung ang mga banda makita sa lungag sa papilit, kini nagpakita nga adunay mga nahabilin nga protina ug uban pang mga macromolecular nga mga butang.

Ⅱ. Balikbalik nga transkripsyon

Human makompleto ang RNA extraction, kinahanglan kining i-reverse ngadto sa cDNA para sa sunod nga mga eksperimento, mao nga ang reversal nga lakang gikinahanglan.Ang reverse transcription ipaila gikan sa pagpili sa reverse transcriptase ug primer:

Reverse transcriptase nga pagpili:

Ang kasagaran nga reverse transcriptases naglakip sa AMV RTase ug MMLV RTase.Ang RNase H sa AMV RTase adunay kusog nga kalihokan, mubo nga gitas-on sa synthesis, ubos nga kantidad sa synthesis ug maayo nga kalig-on sa kainit (42 ~ 55 ℃).Ang kalihokan sa RNase H sa MMLV RTase huyang, ang gitas-on sa synthesis taas, ang kantidad sa synthesis taas, ug ang kalig-on sa thermal dili maayo (37 ~ 42 ℃).

Tungod kay ang RNase H enzyme adunay function sa pagpaubos sa template sa RNA, ang MMLV nga adunay huyang nga kalihokan sa RNase H kinahanglan nga pilion nga pilion sa panahon sa reverse transcription, ug pagkahuman sa genetic engineering, ang thermal stability sa MMLV nakaabot sa usa ka qualitative leap.Pagkuha sa ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV para sa reverse transcription) isip usa ka pananglitan, kini usa ka bag-ong reverse transcriptase nga gipahayag sa E. coli engineered bacteria gamit ang genetic recombination technology.Kini usa ka recombinant nga DNA polymerase nga nag-synthesize sa usa ka komplementaryong DNA strand gikan sa single-stranded RNA, DNA, o usa ka RNA:DNA hybrid.Kini walay RNase H nga kalihokan, lig-on nga kalig-on, lig-on nga RNA affinity, ug taas nga pagkasensitibo sa detection.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV para sa reverse transcription)

Pagpili sa primer:

Kasagaran ang mga primer sa RT nahulog sa tulo ka mga kategorya: oligo dT, mga random nga primer, ug mga primer nga piho sa gene.Pilia ang angay nga mga primer para gamiton sumala sa lain-laing kinahanglanon sa eksperimento.

1. Kung ang template gikan sa eukaryotic nga gigikanan ug ang ulahi nga cDNA gigamit alang sa naandan nga pagpadako sa PCR, girekomenda ang Oligo (dT);Kung ang sunod nga eksperimento gigamit lamang alang sa qPCR, ang Oligo (dT) girekomenda nga isagol sa mga random nga primer aron mapauswag ang kahusayan sa reverse transcription.

2. Kung ang template gikan sa prokaryotes, ang Random Primers o gene specific primers kinahanglang pilion para sa reverse transcription.

Ⅲ.qPCR

Ang pagkuwenta sa fluorescence nag-una nga gipatin-aw gikan sa pagpili sa mga pamaagi sa quantitative, mga prinsipyo sa disenyo sa primer, pagpili sa ROX, pagsumpo sa sistema sa reaksyon ug setting sa kondisyon sa reaksyon, ug uban pa.

Pagpili sa quantitative nga mga pamaagi:

Ang mga pamaagi sa quantitative gibahin sa relatibong quantitative nga mga pamaagi ug absolute quantitative nga mga pamaagi.Ang relatibong quantification mahimong magamit aron mahibal-an ang epekto sa pipila nga mga pamaagi sa pagtambal sa ekspresyon sa gene, mahibal-an ang kalainan sa ekspresyon sa gene sa lainlaing mga panahon ug itandi ang kalainan sa ekspresyon sa gene sa lainlaing mga tisyu.Ang hingpit nga pag-ihap makamatikod sa gidaghanon sa nucleic acid sa virus ug uban pa.Sa pagbuhat sa mga eksperimento, kita kinahanglan gayud nga mopili sa angay nga quantitative mga pamaagi sumala sa atong kaugalingong mga eksperimento.

Panguna nga mga prinsipyo sa disenyo:

Ang disenyo sa primer para sa qPCR direkta nga may kalabutan sa amplification efficiency ug product specificity.Busa, ang husto nga pagdesinyo sa maayong mga primer mao ang unang lakang sa malampuson nga qPCR.Sa disenyo sa primer, ang mosunod nga mga prinsipyo kinahanglang hatagan ug pagtagad sa dihang makatagbo sa prinsipyo sa naandang primerong disenyo:

1. Ang gitas-on sa target nga tipik kontrolado tali sa 100 ug 300 bp;

2. Cross-exon nga disenyo aron malikayan ang impluwensya sa genomic DNA;

3. Ang gidesinyo nga mga primer kinahanglan nga sulayan alang sa pagkaayo sa pagpadako, ug kung ang kahusayan sa pagpadako makaabut sa sukaranan (90-110%) mahimo silang magamit alang sa mga eksperimento sa quantitative;

4. Ang konsentrasyon sa primer kasagarang gi-optimize tali sa 0.1uM ug 1.0uM.

Pagpili saROX:

Sa proseso sa quantitative nga reaksyon, ang ROX mahimong mag-adjust sa optical path difference, pipetting error o volume difference nga gipahinabo sa evaporation ug condensation nga parehas, pagpaayo sa repeatability sa mga resulta.Bisan pa, kinahanglan nga hinumdoman nga ang pagpili sa ROX adunay kalabotan sa instrumento.Kung ang instrumento sa qPCR adunay function sa awtomatikong pagtul-id sa kalainan tali sa mga lungag, dili kinahanglan nga idugang ang ROX;kung dili, kinahanglan nga idugang ang pagkorihir sa ROX.Ang gagmay nga mga kauban sa pagpalit sa mga reagents kinahanglan nga sumala sa instrumento nga gigamit sa pagpili sa husto nga ROX, paglikay sa ulahi nga mga sayup.

Pag-andam sa sistema sa reaksyon:

Ang mga volume sa reaksyon nga 20ul ug 50ul gipalabi.Ang mosunod nga mga butang kinahanglan nga hatagan ug pagtagad sa diha nga ang sistema giporma:

1. Ang sistema sa reaksyon kinahanglang andamon pinaagi sa bentilasyon sa ultra-clean workbench, bag-ong ddH₂Ang O gigamit alang sa matag eksperimento;

2. Ang matag eksperimento kinahanglan nga mag-andam sa NTC aron mapamatud-an kung adunay polusyon sa sistema, ug ang matag parisan sa mga primer kinahanglan nga magbuhat sa NTC sa pag-andam sa sistema;

3. Aron mahibal-an kung adunay nahabilin nga gDNA sa template sa RNA, ang NRT mahimong andamon alang sa matag sample alang sa pag-ila;

4. Sa diha nga ang pag-andam sa sistema, kini girekomendar sa pagbuhat sa labing menos 3 teknikal nga pagbalik-balik alang sa usa ka sample;

5. Sa diha nga ang template mao ang cDNA, kini girekomendar sa dilute 5-10 ka beses sa pagpakunhod sa inhibition epekto sa reverse transcription system sa qPCR eksperimento.Mas maayo nga susihon ang gidaghanon sa template pinaagi sa gradient, aron ang kantidad sa CT mahulog sa taliwala sa 20-30;

6. Tinoa ang gikinahanglan nga gidaghanon sa mga reaksyon, pagdugang sa 5-10% base sa gidaghanon sa mga reaksyon, ug kuwentaha ang gidaghanon sa configuration number;

7, ang sistema giandam gamit ang premix nga prinsipyo, pagsagol human sa centrifugation ug pagsiguro nga walay mga bula;

8, Kutob sa mahimo sa pagpili sa pagsuporta sa consumables.

May kalabotan nga RT-qPCR Kit