Sterilisasyon sa mga tip sa pipette ug EP tubes, ug uban pa.

1. Pag-andam og 0.1% (usa ka libo) nga DEPC (highly toxic substance) nga adunay deionized nga tubig, gamita kini pag-ayo sa usa ka fume hood, ug ibutang kini sa 4°C layo sa kahayag;

Ang tubig sa DEPC mao ang lunsay nga tubig nga gitambalan sa DEPC ug gi-sterilize sa taas nga temperatura ug taas nga presyur.Gisulayan nga libre sa RNase, DNase ug proteinase.

2. Ibutang ang pipette tip ug EP tube ngadto sa 0.1% DEPC, ug siguroha nga ang pipette tip ug EP tube napuno sa 0.1% DEP.

3. Panalipdi gikan sa kahayag, pabarug, tibuok gabii (12-24h)

4. Ang kahon nga adunay sulud nga tip ug EP tube dili kinahanglan nga matumog sa DEPC.Human matangtang ang tubig sa DEPC sa tumoy o tubo sa EP, iputos kini ug iputos.

5. 121 degrees Celsius, 30min

6. 180 degrees Celsius, uga sulod sa pipila ka oras (labing menos 3 ka oras)

Hinumdomi: a.Pagsul-ob ug latex nga gwantes ug maskara kung mag-atiman sa DEPC!b, o walay DEPC sterilization, 130 ℃, 90min autoclave (daghang mga laboratoryo taas nga temperatura sterilization kaduha)

Mga konsiderasyon sa pagkuha sa RNA

Duha ka dagkong panghitabo sa tissue RNA isolation failure

Ang pagkadaot sa RNA ug mga nahabilin sa mga hugaw sa mga tisyu,bahin sa pagkadaot, atong tan-awon una kung ngano nga ang RNA nga gikuha gikan sa kultura nga mga selula dili dali madaot.Ang naglungtad nga RNA extraction reagents tanan adunay mga sangkap nga paspas nga nagpugong sa RNase.Idugang ang lysate sa kulto nga mga selula, ug isagol lang kini, ang tanan nga mga selula mahimong hingpit nga isagol sa lysate, ug ang mga selula hingpit nga lysed.Human ma-lysed ang mga selyula, ang mga aktibong sangkap sa lysate makapugong dayon sa intracellular RNase, mao nga ang RNA nagpabilin nga wala.Buot ipasabot, tungod kay ang kulto nga mga selula dali ug bug-os nga makontak sa lysate, ang ilang RNA dili daling madaot;sa laing bahin, ang RNA sa tisyu daling madaot tungod kay ang mga selula sa tisyu dili dali nga makontak sa lysate.tungod sa igong kontak.Busa,sa paghunahuna nga adunay usa ka paagi sa paghimo sa tisyu sa usa ka cell samtang nagpugong sa kalihokan sa RNA, ang problema sa pagkadaot mahimong hingpit nga masulbad.

Ang liquid nitrogen milling mao ang labing epektibo nga paagi.Bisan pa, ang pamaagi sa paggaling sa likido nga nitroheno lisud kaayo, labi na kung daghan ang mga sample.Naghatag kini sa sunod nga labing kaayo nga butang: ang homogenizer.AnghomogenizerAng pamaagi wala maghunahuna sa pangutana kung giunsa ang kalihokan sa RNase gipugngan sa wala pa makontak ang mga selyula sa lysate, apan nag-ampo nga ang rate sa pagkaguba sa tisyu mas paspas kaysa sa rate diin ang intracellular RNase nagdaot sa RN.

Ang epekto sa electric homogenizer mas maayo,ug ang epekto sa glass homogenizer dili maayo, apan sa kinatibuk-an, ang homogenizer nga pamaagi dili makapugong sa degradation phenomenon.Busa, kon ang pagkuha mao ang degraded, ang orihinal nga electric homogenizer kinahanglan nga gamiton alang sa paggaling uban sa liquid nitrogen;ang orihinal nga homogenizer sa baso kinahanglan nga usbon sa usa ka electric homogenizer o direkta nga gigaling sa likido nga nitroheno.Ang problema hapit 100% mahimo.masulbad.

Ang problema sa nahabilin nga kahugawan nga nakaapekto sa sunod nga mga eksperimento adunay daghang lainlain nga mga hinungdan kaysa pagkadaot, ug ang mga solusyon magkalainlain.Sa konklusyon,kung adunay pagkadaot o nahabilin nga mga hugaw sa tisyu, ang pamaagi sa pagkuha / reagent alang sa piho nga materyal nga eksperimento kinahanglan nga ma-optimize.Dili nimo kinahanglan nga gamiton ang imong bililhon nga mga sample alang sa pag-optimize: makapalit ka ug pipila ka gagmay nga mga hayop sama sa isda/manok gikan sa merkado, kuhaa ang katugbang nga bahin sa materyal alang sa pagkuha sa RNA, ug ang uban nga bahin alang sa pagkuha sa protina - galinga gamit ang baba, tiyan ug tinai Extract.

Ang target nga RNA sa gikuha nga RNA gigamit alang sa lain-laing mga follow-up nga mga eksperimento, ug ang mga kinahanglanon sa kalidad niini lahi

Ang pagtukod sa librarya sa cDNA nagkinahanglan sa integridad sa RNA nga walay mga residu sa enzyme reaction inhibitors;Ang amihanan nanginahanglan mas taas nga integridad sa RNA ug ubos nga mga kinahanglanon alang sa mga residu sa enzyme reaction inhibitors;Ang RT-PCR wala magkinahanglan ug taas kaayo nga integridad sa RNA,apan nagpugong sa mga reaksiyon sa enzyme.Ang mga kinahanglanon sa nahabilin estrikto.Ang input nagtino sa output;sa matag higayon nga ang tumong mao ang pagkuha sa pinakataas nga kaputli RNA, kini gasto sa mga tawo ug salapi.

Pagkolekta/Pagtipig sa mga Sampol

Mga Factor nga Makaapektar sa Degradasyon Human ang sample mobiya sa buhi nga lawas/o sa orihinal nga pagtubo nga palibot, ang endogenous enzymes sa sample magsugod sa pagdaot sa RNA,ug ang degradation rate nalangkit sa sulod sa endogenous enzymes ug temperatura.Sa naandan, adunay duha lamang ka mga paagi aron hingpit nga mapugngan ang kalihokan sa endogenous enzyme: idugang dayon ang lysate ug homogenize nga hingpit ug paspas;putlon ngadto sa gagmay nga mga piraso ug diha-diha dayon freeze sa liquid nitrogen.Ang duha nga mga pamaagi nanginahanglan paspas nga operasyon.Ang naulahi mao ang angay alang sa tanan nga mga sample, samtang ang kanhi angay lamang alang sa mga tisyu nga adunay ubos nga sulod sa mga selula ug endogenous enzymes ug mas sayon ​​sa homogenize.Sa partikular, ang tisyu sa tanum, atay, thymus, pancreas, spleen, utok, tambok, tisyu sa kaunuran, ug uban pa labing maayo nga ma-frozen nga adunay likido nga nitroheno sa dili pa magpadayon.

Fragmentation ug homogenization sa mga sample

Mga Hinungdan nga Makaapektar sa Pagkadaot ug Paghatag Sample fragmentation mao angalang sa hingpit nga homogenization, nga alang sa kompleto ug kompleto nga pagpagawas sa RNA.Ang mga selula mahimong direkta nga homogenized nga dili mabuak.Ang mga tisyu mahimong homogenized lamang human mabuak.Ang lebadura ug bakterya kinahanglan nga mabuak sa katugbang nga mga enzyme sa dili pa sila mahimong homogenized.Ang mga tisyu nga adunay ubos nga endogenous enzyme content ug mas sayon ​​nga homogenization mahimong madugmok ug homogenized sa usa ka higayon sa lysate pinaagi sa usa ka homogenizer;tisyu sa tanum, atay, thymus, pancreas, spleen, utok, tambok, tisyu sa kaunuran ug uban pang mga sample, Taas sila sa endogenous enzymes o dili dali nga homogenized,busa ang pagkaguba sa tisyu ug homogenization kinahanglan nga himuon nga gilain.Ang labing kasaligan ug labing produktibo nga pamaagi sa pagkabahin mao ang paggaling sa likido nga nitrogen, ug ang labing kasaligan nga pamaagi sa homogenization mao ang paggamit sa usa ka electric homogenizer.Usa ka espesyal nga pahinumdom bahin sa paggaling gamit ang likido nga nitrogen: ang sample kinahanglan nga dili matunaw sa panahon sa tibuuk nga proseso sa paggaling, tungod kay ang mga endogenous nga enzyme mas lagmit nga molihok kung nagyelo.

Pagpili sa lysate

Nakaapekto sa kasayon ​​​​sa operasyon ug ang mga hinungdan sa nahabilin nga endogenous impurities Ang sagad nga gigamit nga mga solusyon sa lysis hapit makapugong sa kalihokan sa RNase.Busa, ang yawe nga punto sa pagpili sa usa ka solusyon sa lysis mao ang pagkonsiderar sa kombinasyon sa pamaagi sa pagputli.Adunay usa ka eksepsiyon:Ang mga sample nga adunay taas nga sulud sa endogenous nga enzyme girekomenda nga gamiton ang usa ka lysate nga adunay sulud nga phenol aron madugangan ang abilidad sa pag-inactivate sa endogenous nga mga enzyme.

Pagpili sa pamaagi sa pagputli

Mga hinungdan nga makaapekto sa nahabilin nga endogenous impurities, extraction speed Para sa limpyo nga mga sample sama sa mga cell, ang makatagbaw nga mga resulta mahimong makuha sa halos bisan unsang pamaagi sa pagputli nga anaa.Apan alang sa daghang uban pang mga sample, labi na kadtong adunay taas nga lebel sa mga hugaw sama sa mga tanum, atay, bakterya, ug uban pa, ang pagpili sa usa ka angay nga pamaagi sa pagputli hinungdanon.Ang kolum nga centrifugal nga pamaagi sa pagputli adunay usa ka paspas nga pagkuha sa katulin ug epektibo nga makatangtang sa mga hugaw nga makaapekto sa sunod nga enzymatic nga reaksyon sa RNA, apan kini mahal (Foregene mahimong magtanyag cost-effective kits, dugang nga mga detalye clickdinhi);gamit ang ekonomikanhon ug klasiko nga mga pamaagi sa pagputli, sama sa LiCl precipitation, mahimo usab nga makakuha og makatagbaw nga mga resulta, apan ang oras sa operasyon taas..

"Tulo ka Disiplina ug Walo ka Atensyon" alang sa RNA Extraction

Disiplina 1:Tapuson ang kontaminasyon sa mga exogenous enzymes.

Nota 1:Estrikto nga magsul-ob og maskara ug gwantes.

Nota 2:Ang centrifuge tubes, Tip heads, pipette rods, electrophoresis tanks, ug experimental benches nga naapil sa eksperimento kinahanglang hingpit nga ilabay.

Nota 3:Ang mga reagents/solusyon nga nalambigit sa eksperimento, ilabina ang tubig, kinahanglang walay RNase.

Disiplina 2:Pag-block sa kalihokan sa endogenous enzymes

Nota 4:Pagpili usa ka angay nga pamaagi sa homogenization.

Nota 5:Pagpili usa ka angay nga lysate.

Nota 6:Kontrola ang pagsugod nga kantidad sa sample.

Disiplina 3:Klaroha ang imong katuyoan sa pagkuha

Nota 7:Sa bisan unsang sistema sa lysate nga nagkaduol sa labing kadaghan nga pagsugod nga kantidad sa sample, ang rate sa kalampusan sa pagkuha mikunhod pag-ayo.

Nota 8:Ang bugtong ekonomikanhon nga sukdanan alang sa malampuson nga pagkuha sa RNA mao ang usa ka kalampusan sa sunod nga mga eksperimento, dili abot.

Panguna nga 10 nga Mga Tinubdan sa Kontaminasyon sa RNase

1. Ang mga tudlo mao ang unang tinubdan sa exogenous enzymes, mao nga ang mga gwantis kinahanglang isul-ob ug ilisan kanunay.Dugang pa, kinahanglan usab nga magsul-ob og mga maskara, tungod kay ang pagginhawa usa usab ka hinungdanon nga gigikanan sa mga enzyme.Ang usa ka dugang nga kaayohan sa pagsul-ob og maskara sa gwantis mao ang pagpanalipod sa eksperimento.

2. Mga tip sa pipette, centrifuge tubes, pipettes - Ang RNase dili ma-inactivate pinaagi sa sterilization nga mag-inusara, busa ang mga tip sa pipette ug centrifuge tubes kinahanglan nga pagtratar uban sa DEPC, bisan kung kini gimarkahan isip DEPC nga pagtratar.Labing maayo ang paggamit sa usa ka espesyal nga katuyoan nga pipette, pagpahid niini sa usa ka 75% nga alkohol nga gapas nga bola sa dili pa gamiton, labi na ang sungkod;dugang pa, siguroha nga dili mogamit ug pangtanggal sa ulo.

3. Ang tubig/buffer kinahanglang walay kontaminasyon sa RNase.

4. Labing menos ang lamesa sa pagsulay kinahanglan nga limpyohan sa 75% nga mga bola nga gapas nga alkohol.

5.Endogenous RNase Ang tanan nga mga tisyu adunay endogenous nga mga enzyme, busa ang dali nga pagyelo sa mga tisyu nga adunay likido nga nitrogen mao ang labing kaayo nga paagi aron makunhuran ang pagkadaot.Ang paagi sa pagtipig/paggaling sa likido nga nitroheno dili gyud kombenyente, apan kini ang bugtong paagi alang sa mga tisyu nga adunay taas nga lebel sa endogenous nga mga enzyme.

6. Mga sample sa RNA Ang mga produkto sa pagkuha sa RNA mahimong adunay mga timailhan sa kontaminasyon sa RNase.

7. Plasmid extraction Ang plasmid extraction kasagarang naggamit sa Rnase sa pagpaubos sa RNA, ug ang nahabilin nga Rnase kinahanglang tunawon sa Proteinase K ug makuha sa PCI.

8. Pagtipig sa RNA Bisan kung kini gitipigan sa ubos nga temperatura, ang pagsubay sa gidaghanon sa RNase mahimong hinungdan sa pagkadaot sa RNA.Ang labing kaayo nga solusyon alang sa dugay nga pagpreserbar sa RNA mao ang pagsuspinde sa asin/alkohol, tungod kay ang alkohol nagpugong sa tanan nga kalihokan sa enzymatic sa mubu nga temperatura.

9. Kung ang mga cation (Ca, Mg) adunay kini nga mga ions, ang pagpainit sa 80C sulod sa 5 ka minuto ang hinungdan sa pag-cleaved sa RNA, busa kung kinahanglan nga ipainit ang RNA, ang solusyon sa pagpreserba kinahanglan adunay sulud nga chelating agent (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).

10. Ang mga enzyme nga gigamit sa sunod nga mga eksperimento mahimong kontaminado sa RNase.

10 Mga Tip sa Pagkuha sa RNA

1: Dali nga mapugngan ang kalihokan sa RNase.Ang mga sample dali nga nagyelo pagkahuman sa pagkolekta, ug ang RNase dili aktibo sa paspas nga operasyon sa panahon sa lysis.

2: Pagpili usa ka angay nga pamaagi sa pagkuha alang sa tisyu nga adunay taas nga sulud sa ribozyme, ug ang adipose tissue labing maayo nga gamiton ang pamaagi nga adunay phenol.

3: Ang kalidad sa panagna nagkinahanglan sa Northern, cDNA library nga pagtukod nagkinahanglan og taas nga integridad, ug ang RT-PCR ug RPA (Ribonuclease protection assay) wala magkinahanglan og taas nga integridad.Ang RT-PCR nagkinahanglan og taas nga kaputli (mga residu sa enzyme inhibitor).

4: Ang hingpit nga homogenization mao ang yawe sa pagpalambo sa abot ug pagkunhod sa pagkadaut.

5: Susiha ang integridad sa RNA electrophoresis detection, 28S: 18S = 2: 1 mao ang usa ka bug-os nga ilhanan, 1: 1 madawat usab alang sa kadaghanan sa mga eksperimento.

6: Pagtangtang sa DNA para sa RT-PCR, array analysis Labing maayo nga gamiton ang Dnase I aron matangtang ang DNA.

7: Pagpakunhod sa kontaminasyon sa exogenous enzymes - enzymes dili imported gikan sa gawas.

8: Kung magkonsentrar sa ubos nga konsentrasyon nga nucleic acid, kinahanglan nga idugang ang usa ka co-precipitation reagent.Apan aron mapugngan ang co-precipitant nga adunay mga enzyme ug kontaminasyon sa DNA.

9: Hingpit nga dissolve ang RNA, kon gikinahanglan, init sa 65C sulod sa 5 minutos.

angay nga paagi sa pagtipig

Mahimo kining tipigan sa -20C sa mubo nga panahon, ug sa -80C sa taas nga panahon.Ang unang lakang sa pagpauswag sa abot sa RNA mao ang pagkaamgo nga ang sulod sa RNA sa lain-laing mga sample managlahi kaayo.Taas nga abundance (2-4ug/mg) sama sa atay, pancreas, kasingkasing, medium abundance (0.05-2ug/mg) sama sa utok, embryo, kidney, baga, thymus, ovary, low abundance (<0.05ug/mg) mg) sama sa pantog, bukog, tambok.

1: Lyse cells aron buhian ang RN - kung dili ipagawas ang RNA, ang ani mokunhod.Ang electric homogenization mas maayo kay sa ubang mga pamaagi sa homogenization, apan mahimo usab nga kinahanglan nga ikombinar sa ubang mga pamaagi, sama sa liquid nitrogen mashing, enzymatic digestion (Lysozyme/Lyticase)

2: Pag-optimize sa pamaagi sa pagkuha.Ang pinakadako nga problema sa phenol-based nga mga pamaagi mao ang dili kompleto nga stratification ug partial RNA loss (ang supernatant dili hingpit nga makuha).Ang dili kompleto nga stratification tungod sa taas nga nucleic acid ug protina nga sulod, nga masulbad pinaagi sa pagdugang sa gidaghanon sa lysate nga gigamit o pagkunhod sa gidaghanon sa sample.Usa ka lakang sa pagkuha sa chloroform ang gidugang sa adipose tissue.Ang pagkawala sa RNA mahimong mapakunhod pinaagi sa back-pumping o pinaagi sa pagtangtang sa organikong layer nga gisundan sa centrifugation.Ang pinakadako nga problema sa column centrifugation-based nga mga pamaagi mao ang sobra nga sample.

Mga Tip sa Pagkuha sa Klasiko

1. Phenol purification: Pagdugang og patas nga gidaghanon sa 1:1 Phenol/Chloroform ug kusog nga sagol sulod sa 1-2 ka minuto.Centrifuge sa high speed sulod sa 2 minutos.Pag-ayo kuhaa ang supernatant (80-90%).Ayaw pag-adto sa tunga nga layer.Ang parehas nga gidaghanon sa solusyon sa reaksyon mahimong idugang sa Phenol / Chloroform ug makuha ang supernatant.Ang duha ka supernatant mahimong isagol alang sa nucleic acid precipitation aron mapalambo ang abot.Ayaw paghinayhinay sa pagsagol, ug ayaw pagsulay sa pagtangtang sa tanan nga supernatant.

2. Paghugas gamit ang 70-80% nga ethanol: Atol sa paghugas, ang nucleic acid kinahanglan nga suspindihon aron masiguro nga ang nahabilin nga asin mahugasan.Sa samang higayon, diha-diha dayon human sa pagbubo sa ethanol, centrifuge sa high speed alang sa usa ka pipila ka segundo, ug unya kuhaa ang nahabilin nga ethanol sa usa ka pipette.Dissolve human sa pagbarug sa lawak temperatura alang sa 5-10 minutos.

11. Pagkuha sa mga espesyal nga organisasyon

1. Fibrous tissue: Ang yawe sa RNA extraction gikan sa fibrous tissue sama sa kasingkasing/skeletal muscle mao ang hingpit nga pagbungkag sa tissue.Kini nga mga tisyu adunay ubos nga densidad sa selula, mao nga ang gidaghanon sa RNA kada yunit nga gibug-aton sa tisyu ubos, ug labing maayo nga gamiton ang daghang pagsugod nga kantidad kutob sa mahimo.Siguroha nga galingon pag-ayo ang tisyu ubos sa nagyelo nga mga kondisyon.

2. Mga tisyu nga adunay taas nga protina / tambok nga sulod: taas ang sulod sa tambok sa utok / utanon.Human sa PCI extraction, ang supernatant adunay puti nga floccules.Ang supernatant kinahanglan nga makuha pag-usab gamit ang chloroform.

3. Mga tisyu nga adunay taas nga nucleic acid/ribozyme content: ang spleen/thymus adunay taas nga nucleic acid ug ribozyme content.Ang paggaling sa tisyu ubos sa nagyelo nga mga kondisyon nga gisundan sa paspas nga homogenization mahimong epektibo nga dili aktibo ang ribozymes.Apan, kung ang lysate sobra ka lapot (tungod sa taas nga nucleic acid content), ang PCI extraction dili makahimo sa stratify nga epektibo;Ang pagdugang sa dugang nga lysate makasulbad niini nga isyu.Ang daghang mga extraction sa PCI makatangtang sa daghang nahabilin nga DNA.Kung ang usa ka puti nga precipitate maporma dayon pagkahuman sa pagdugang sa alkohol, kini nagpaila sa kontaminasyon sa DNA.Ang re-extraction nga adunay acidic nga PCI pagkahuman sa pagkatunaw makatangtang sa kontaminasyon sa DNA.

4. Ang tisyu sa tanum: Ang tisyu sa tanum mas komplikado kaysa tisyu sa hayop.Kasagaran, ang mga tanum gigaling sa ilawom sa likido nga nitrogen nga mga kondisyon, busa ang pagkadaot sa RNA pinaagi sa endogenous nga mga enzyme dili kasagaran.Kung ang problema sa pagkadaot dili masulbad, hapit kini tungod sa mga hugaw nga anaa sa sample.Ang mga hugaw nga anaa sa daghang mga tanum mosangpot sa mga residues, ug ang rason sa mga residues kasagaran tungod kay kini nga mga hugaw adunay pipila ka mga kaamgiran sa RNA: ikaw precipitate ug ako precipitate, ug ikaw adsorb ug ako adsorb.Kini nga mga kinaiya nagtino nga sila kusgan kaayo nga mga inhibitor sa enzyme.

Sa pagkakaron, ang komersyal nga RNA extraction reagents mahimong ipahiangay sa hapit tanan nga mga tisyu sa hayop nga adunay gagmay nga mga pag-adjust, apan adunay pipila nga mga komersyal nga RNA extraction reagents nga mahimong angay alang sa kadaghanan sa mga tisyu sa tanum.Maayo na lang, ang Foregene makahatag ug espesyaltanom nga RNA extraction kit, naa miTanum Total RNA Isolation kit, Tanum Total RNA Isolation kit Plus.Ang ulahi espesyal nga gidisenyo alang sa mga tanum nga adunay taas nga polysaccharide ug polyphenol nga sulud.Alang sa pagkuha sa RNA, ang feedback gikan sa mga tiggamit sa lab labi ka maayo.

12. Ang epekto sa sample nga pagyelo ug pagtunaw Ang frozen nga sample mahimong mas dako, ug kini kinahanglan nga putlon sa dili pa gamiton alang sa RNA extraction.Ang mga sample lagmit nga matunaw (posible nga partially) sa panahon sa pagputol.Mahimong kinahanglan nga timbangon ang mga frozen nga sample sa dili pa makuha ang RNA, ug ang pagtunaw mahitabo sa panahon niini nga proseso.Usahay, ang pagtunaw sa sample mahitabo usab sa panahon sa proseso sa paggaling sa likido nga nitrogen;o ang frozen nga sample direkta nga idugang sa lysate nga walay liquid nitrogen milling, ug ang pagtunaw mahitabo sa dili pa ang hingpit nga homogenization.Gipakita sa mga eksperimento nga ang nagyelo nga tisyu mas dali nga madaot ang RNA sa panahon sa pagtunaw kaysa presko nga tisyu.Ang lagmit nga rason: Ang proseso sa freeze-thaw makabalda sa mga istruktura sulod sa selula, nga makapasayon ​​sa endogenous enzymes nga direktang makontak sa RNA.

13. Paghukom sa kalidad sa RNA Kasagaran, ang electrophoresis gigamit sa paghukom sa integridad sa RNA, ug ang A260/A280 gigamit sa paghukom sa kaputli sa RNA.Sa teorya, ang intact nga RNA adunay ratio nga 28S:18S = 2.7:1, ug kadaghanan sa datos nagpasiugda sa ratio nga 28S:18S = 2:1.Ang kamatuoran mao nga halos walay RNA nga nakuha gikan sa mga sample gawas sa mga selula anaa sa 2:1 ratio (kini nakuha gamit ang Agilent Bioanalyzer).

Ang mga resulta sa electrophoresis sa RNA maapektuhan sa daghang mga hinungdan, lakip ang sekondaryang istruktura, kondisyon sa electrophoresis, sample load, degree sa saturation sa EB, ug uban pa. Gamita ang lumad nga electrophoresis aron makit-an ang RNA ug gamiton ang DNA Marker isip kontrol.Kung ang 28S sa 2kb ug ang 18S sa 0.9kb klaro, ug ang 28S: 18S> 1, ang integridad makatagbo sa mga kinahanglanon sa kadaghanan sa sunod nga mga eksperimento.

Ang A260/A280 usa ka timailhan nga hinungdan sa daghang kalibog.Una sa tanan, gikinahanglan nga ipatin-aw ang orihinal nga kahulogan niini nga timailhan alang sa mga nucleic acid: puro nga RNA, ang A260/280 niini = mga 2.0.Ang putli nga RNA mao ang 'hinungdan' ug ang A260/A280 = 2 mao ang 'epekto'.Karon ang tanan naggamit sa A260/A280 isip usa ka 'hinungdan', naghunahuna nga "kung A260/A280 = 2, nan ang RNA puro", nga natural nga mosangpot sa kalibog.

Kung interesado ka, mahimo nimong idugang ang gamay nga reagent nga sagad gigamit sa pagkuha, sama sa phenol, guanidine isothiocyanate, PEG, ug uban pa, sa imong sample sa RNA, ug dayon sukda ang ratio nga A260 / A280.Ang tinuod mao nga daghan sa mga reagents nga gigamit alang sa RNA extraction, ingon man usab sa daghang mga hugaw sa sample, mosuhop sa palibot sa A260 ug A280, nga makaapekto sa A260/A280.

Ang labing makatudlo nga pamaagi sa pagkakaron mao ang pag-scan sa mga sample sa RNA sa 200-300 nm range.Ang kurba sa puro nga RNA adunay mga mosunod nga mga kinaiya: ang kurba hapsay, A230 ug A260 duha ka mga punto sa inflection, A300 duol sa 0, A260/A280 = sa palibot sa 2.0, ug A260/A230 = sa palibot sa 2.0.Kung ang data sa pag-scan wala magamit, ang ratio nga A260/A230 kinahanglan usab nga matino, tungod kay kini nga ratio mas sensitibo sa pagdala sa tanan nga mga hugaw nga makaapekto sa reaksyon sa enzymatic.Tagda ang linear range sa device (0.1–0.5 para sa A260).

Adunay duha ka laing mapuslanon nga panghitabo: ang ratio mahimong mga 0.3 nga mas ubos kung ang A260/A280 gisukod sa tubig;samtang ang ratio nga gisukod sa 10 mM EDTA maoy mga 0.2 nga mas taas kay sa gisukod sa 1 mM EDTA.

May kalabotan nga mga produkto:

China Plant Total RNA Isolation Kit Manufacturer ug Supplier |Foregene (foreivd.com)

RNA isolation series Suppliers ug Factory |China RNA isolation series Manufacturers (foreivd.com)

RNA isolation series - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)