Kami adunay kasinatian nga tiggama.Ang pagdaog sa kadaghanan sa hinungdanon nga mga sertipikasyon sa merkado niini alang sa Dakong diskwento sa China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Ang kalidad mao ang kinabuhi sa pabrika, Pag-focus sa panginahanglan sa kustomer mao ang gigikanan sa pagkaluwas ug pag-uswag sa kompanya, Gisunod namon ang pagkamatinud-anon ug maayong pamatasan sa pagtrabaho, nagpaabut sa imong pag-abut!
Kami adunay kasinatian nga tiggama.Pagdaog sa kadaghanan sa hinungdanon nga mga sertipikasyon sa merkado niiniChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Ang among kompanya nagsaad: makatarunganon nga mga presyo, mubo nga oras sa produksiyon ug makatagbaw nga serbisyo pagkahuman sa pagbaligya, giabiabi ka usab namon nga bisitahan ang among pabrika sa bisan unsang oras nga gusto nimo.Hinaut nga kita adunay usa ka nindot ug taas nga termino nga negosyo nga magkauban!!!

Mga paghulagway

Kini nga kit naggamit sa usa ka talagsaon nga lysis buffer system nga dali nga makapagawas sa RNA gikan sa kultura nga mga sample sa selula alang sa mga reaksyon sa RT-qPCR, sa ingon mawagtang ang makahurot sa panahon ug hago nga proseso sa pagputli sa RNA.Ang template sa RNA mahimong makuha sa 7 minuto lang.Ang 5×Direct RT Mix ug 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents nga gihatag sa kit dali ug epektibong makakuha ug real-time quantitative PCR results.

5×Direct RT Mix ug 2×Direct qPCR Mix-SYBR adunay lig-on nga inhibitor tolerance, ug ang lysate sa mga sample mahimong gamiton ingon nga template alang sa RT-qPCR direkta.Kini nga kit naglangkob sa talagsaon nga RNA high-affinity nga Foregene reverse transcriptase, ug Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaction buffer, PCR optimizer ug stabilizer.

Mga detalye

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Mga sangkap sa kit

Mga bahin ug bentaha

■ Yano ug epektibo : gamit ang Cell Direct RT nga teknolohiya, ang mga sample sa RNA mahimong makuha sulod lang sa 7 minutos.

■ Ang sample nga panginahanglan gamay ra, ingon ka ubos sa 10 ka mga selula ang mahimong masulayan.

■ Taas nga throughput: kini dali nga makamatikod sa RNA sa mga selula nga gi-culture sa 384, 96, 24, 12, 6-well plates.

■ Ang DNA Eraser dali nga makatangtang sa gipagawas nga mga genome, makapakunhod pag-ayo sa epekto sa sunod nga mga resulta sa eksperimento.

■ Ang na-optimize nga RT ug qPCR nga sistema naghimo sa duha ka lakang nga RT-PCR reverse transcription nga mas episyente ug mas espesipiko ang PCR, ug mas makasugakod sa RT-qPCR reaction inhibitors.

Aplikasyon sa kit

Kasangkaran sa aplikasyon: kultura nga mga selula.

- RNA nga gipagawas pinaagi sa sample lysis: magamit lamang sa RT-qPCR template niini nga kit.

- Ang kit mahimong gamiton alang sa mosunod nga mga katuyoan: gene expression analysis, verification sa siRNA-mediated gene silencing effect, drug screening, etc.

Diagram

Pagtipig ug kinabuhi sa estante

Part I niini nga kit kinahanglan nga tipigan sa 4 ℃;Part II kinahanglan nga gitipigan sa -20 ℃.

Ang Foregene Protease Plus II kinahanglan nga tipigan sa 4 ℃, ayaw pag-freeze sa -20 ℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR kinahanglan tipigan sa -20 ℃ sa kangitngit;kung gigamit kanunay, mahimo usab kini tipigan sa 4 ℃ alang sa hamubo nga pagtipig (gamiton sulod sa 10 ka adlaw) .Nasinati na namo ang tiggama.Ang pagdaog sa kadaghanan sa hinungdanon nga mga sertipikasyon sa merkado niini alang sa Dako nga diskwento sa China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Ang kalidad mao ang kinabuhi sa pabrika, Pag-focus sa panginahanglan sa kustomer mao ang gigikanan sa pagkaluwas ug pag-uswag sa kompanya, Gisunod namon ang pagkamatinud-anon ug maayong pamatasan sa pagtrabaho, nagpaabut sa imong pag-abut!
Dako nga diskwentoChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Ang among kompanya nagsaad: makatarunganon nga mga presyo, mubo nga oras sa produksiyon ug makatagbaw nga serbisyo pagkahuman sa pagbaligya, giabiabi ka usab namon nga bisitahan ang among pabrika sa bisan unsang oras nga gusto nimo.Hinaut nga kita adunay usa ka nindot ug taas nga termino nga negosyo nga magkauban!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Para sa cell direct RT-qPCR gamit ang ≤ 1000,000 ka mga cell

Pagpaila sa produkto

Kini nga produkto naggamit sa usa ka talagsaon nga lysis buffer system aron dali nga buhian ang RNA gikan sa kultura nga mga sample sa cell alang sa mga reaksyon sa RT-qPCR, pagwagtang sa makahurot sa panahon ug hago nga proseso sa pagputli sa RNA, ug 7 minuto lamang aron makuha ang gikinahanglan nga template sa RNA, nga adunay 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman nga gihatag sa kit dali ug epektibo nga makakuha og real-time nga mga resulta sa PCR.

5× Direct RT Mix ug 2× Direct qPCR Mix-Taqman adunay lig-on nga inhibitor tolerance ug makahimo sa episyente nga pagbalit-ad ug espesipikong pagpadako gamit ang lysate sa sample nga sukdon isip template.Ang reagent adunay Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer ug Stabilizer, nga magamit sa lysis buffer aron dali ug dali nga makit-an ang mga sampol, ug adunay mga kinaiya sa taas nga pagkasensitibo, espesipiko ug kalig-on.

Mga bahin sa produkto

Yano, epektibo nga teknolohiya sa Cell Direct RT nga nagkinahanglag 7 minuto aron makakuha mga sample sa RNA.

Gamay ang mga kinahanglanon sa sample, ug labing gamay nga 10 ka mga kultura nga mga selyula mahimong magamit alang sa pag-eksperimento.

Taas nga throughput alang sa paspas nga pag-angkon sa RNA sa mga kultura nga mga selula sama sa 384, 96, 24, 12, ug 6-well plate.

Ang DNA Eraser dali nga makatangtang sa gipagawas nga mga genome, nga makapamenos sa epekto sa sunod nga mga resulta sa eksperimento.

Ang na-optimize nga RT ug qPCR nga mga sistema makapahimo sa duha ka lakang nga RT-PCR nga adunay mas episyente nga reverse transcription, specificity, ug mas lig-on nga RT-qPCR reaction inhibitor tolerance.

Aplikasyon sa kit

Kasangkaran sa aplikasyon: Kultura nga mga selula.

Sample lysis gihubad RNA: gigamit lamang ingon nga usa ka duha ka-lakang nga RT-qPCR template.

Ang mga kit mahimong gamiton alang sa mosunod nga mga katuyoan: pagtuki sa ekspresyon sa regulasyon sa gene, pagsulay sa allele, pag-screen sa droga, ug uban pa.

Mga limitasyon sa kit

Gipadako nga mga tipik ≤ 300 bp.

Ang mga kit gigamit sa bag-ong kultura nga mga selula.

Pagkontrol sa kalidad sa produkto

Sumala sa Total Quality Management System sa FOREGENE, ang matag batch sa Cell Direct RT-qPCR series kits hugot nga gisulayan sa makadaghang higayon aron maseguro ang pagkakasaligan ug kalig-on sa kalidad sa matag batch sa mga kit.

Mga sulod sa kit

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman mahimong mapalit nga gilain, ang mga detalye gihatag sa Appendix 1 (PAGE 13).

Mga kahimtang sa pagtipig

1. Mga Kondisyon sa Pagpadala

Ang tibuok nga proseso sa ubos nga temperatura nga ice pack box nga transportasyon, aron masiguro nga ang kit anaa sa <4 °C nga estado.

2. Mga kahimtang sa pagtipig

Tipigi ang bahin I sa 4°C ug Part II sa -20°C.

Ang Foregene Protease Plus II kinahanglang tipigan sa 4°C, dili frozen sa -20°C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman gitipigan sa -20°C, o sa 4°C para sa hamubo nga panahon nga paggamit kon kanunay gamiton (sulod sa 10 ka adlaw).

Impormasyon sa sangkap sa kit

Buffer CL: Naghatag sa palibot nga gikinahanglan alang sa mga reaksiyon sa cell lysis.

Buffer ST: Gitapos ang aktibong substansiya sa lysate aron malikayan ang mga epekto sa sunod nga RT.

DNA Eraser: DNA remover, ang epekto sa pagtangtang sa genome sa sunod nga mga eksperimento.

5× Direct RT Mix: Naglangkob sa taas nga RNA affinity Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, ug reverse transcription primers alang sa kamalaumon nga pag-align (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Sa konteksto sa lysis buffer, ang mga selula gi-lysed aron buhian ang mga nucleic acid.

2 × Direct qPCR Mix-Taqman: Kini nga reagent adunay Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaction buffer, PCR optimizer, ug stabilizer.

20 × ROX Reference Dye: Kasagaran nga gigamit sa Real Time PCR amplification instruments sa ABI, Stratagene ug uban pang mga kompanya, gigamit kini aron ayohon ang kalainan tali sa PCR tubes ug tubes tungod sa mga sayup sa dosing sa PCR.Ang 20 × ROX Reference Dye nga konsentrasyon nga gikinahanglan alang sa lain-laing mga instrumento lahi, ug ang user makadugang niini sumala sa girekomendar nga konsentrasyon sa instrumento.

RNase-Free ddH₂O: RNase-free sterilized ultra puro nga tubig alang sa duha ka-lakang nga RT-qPCR reaksyon.

Panagana:(Siguruha nga basahon pag-ayo ang mga panagana sa dili pa gamiton ang kit)

Hatagi'g pagtagad ang pamaagi sa operasyon sa eksperimento aron malikayan ang cross-contamination tali sa mga sample.

Hatagi'g pagtagad ang kalimpyo sa eksperimento nga palibot ug mga galamiton aron malikayan ang kontaminasyon sa RNase ug pagkadaut sa RNA.

Pagkuha ug presko o maayong pagkapreserbar nga mga sample sa cell ug ayaw gamita ang balikbalik nga freeze-thawed nga mga sample sa cell.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman kinahanglan nga likayan ang balik-balik nga freeze-thaw, kon dili kini makaapekto sa reverse transcription ug PCR efficiency.

Pag-andamrasyonkaniadtooperasyon

Siguroha nga basahon pag-ayo ang mga instruksyon sa dili pa gamiton kini nga kit.Ang Cell Direct RT-qPCR Kit kay simple, sayon, ug paspas sa pag-operate, ug ang mga instruksyon naghatag ug kompletong impormasyon mahitungod sa tibuok kit ug unsaon paggamit niini sa saktong paagi.Palihug pag-andam sa gikinahanglan nga mga materyal sa eksperimento ug kagamitan sa dili pa gamiton.

Mga eksperimento nga materyales ug kagamitan

◆ Mga selula sa kultura.

◆ 1.5 ml o 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-Free tip, 0.2 ml sterile qPCR tube.

◆ qPCR machine, pipette, tabletop centrifuge (≥13,400×g) (depende sa eksperimento nga mga panginahanglan), ug uban pa.

Kaluwasan

◆ Kini nga produkto alang lamang sa mga katuyoan sa panukiduki sa siyensya, palihug ayaw kini gamita alang sa mga katuyoan sa parmasyutiko, klinikal, pagkaon ug kosmetiko.

◆ Kung mogamit ug kemikal, pagsul-ob ug angay nga lab nga sinina, gwantis, protective glasses, etc.

Operasyonmga giya

Ang mga sistema sa Cell Lysis, mga sistema sa RT, ug mga suplemento sa solusyon sa reaksyon sa qPCR mahimong mapalit nga gilain, alang sa mga detalye sa Appendix 1 (PAGE 13).

Giya sa operasyon

A: Sample nga pagpagawas sa RNA

1. Ang mga selyula pretreated: Hugasi ang cell culture plate gamit ang bugnaw nga PBS, dayon lyse ang mga cell (10-10⁶), 10⁶ kay sa gidaghanon sa mga selula, girekomendar nga Foregene ang Cell ug RNA Isolation Kit ang Total (DE-03111) o Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) para sa RNA extraction ug purification.

1.1.Adherent cells (24- well plate isip pananglitan)

1.1.1.Tinoa ang gidaghanon sa mga selula sa matag atabay, tinoa nga ang gidaghanon sa mga selula mao ang 1 × 10⁵, ug gamita ang pipette aron makuha ang medium nga kultura gikan sa pinggan sa kultura.

1.1.2.Idugang ang 200 μl nga pre-chilled 1 × PBS sa matag atabay.Ayaw pag-pipet og balik-balik ug kuhaa ang PBS gikan sa mga atabay.Ikiling ang plato ug kuhaa ang PBS kutob sa mahimo.Padayon sa lakang 2.

1.1.3.Lahi nga cell culture dish o usa ka reference number table 1-1 sa usa ka cell culture dish gidugang nga precooled 1 × PBS para sa cell washing.

Talaan 1-1: PBS nga dosis para sa lain-laing gidaghanon sa mga selula

Nota:Aron masiguro ang usa ka lig-on nga pagsunod sa mga selula,dako nga gidaghanon sa pagkawala sa cell malikayan sa dihang manghugas .

1.2.Suspension cells o adherent cells nga gikulata sa dili porous nga mga plato

1.2.1.Ang nagsunod nga mga selula nga gikulata sa dili-multi well plates (suspension cells magsugod gikan sa sunod nga lakang 1.2.2), pagkolekta ug pagbulag sa mga selula sumala sa normal nga pamaagi sa pagkolekta sa selula, ug ibutang kini sa usa ka culture plate o centrifuge tube;kung gigamit ang trypsinization, kinahanglan ang centrifugation aron makolekta ang mga selyula ug aron makuha ang nahabilin nga trypsin, gidugang ang PBS nga gisuspinde nga mga selyula sa indibidwal nga mga selyula aron mabungkag ang mga selyula.

1.2.2.Human sa gidaghanon sa mga selula nga maihap, aliquoted mga selula 1 × 10⁵ usa sa centrifuge tubes, pagkolekta sa mga cell pinaagi sa centrifugation sa 1000 × g alang sa 10 min.

1.2.3.Idugang ang 200 μl PBS sa centrifuge tube, ayaw pag-pipet balik-balik, ug direkta nga aspirate ang PBS.ipadayon ang lakang 2. (Kung lisud ang pag-precipitate ug ang mga selyula gisuspinde pag-usab, mahimong ipahigayon 1000 × g centrifuged 10 min human sa paglabay sa supernatant, ang cell pellet mopadayon sa lakang 2)

2.Cell lysis: Kuhaa ang Buffer CL, ang temperatura niini gibalanse sa temperatura sa lawak, DNA Eraser ug Foregene Protease Plus II, sumala sa mosunod nga lamesa 1-2 nga giandam nga lysis system: (Ang solusyon sa Lysis andam na alang sa paggamit).

Talaan 1-2: cleavage pag-andam sa sistema (Pahinumdom: sa pag-andam sa yelo)

3.( 24 –well plate isip usa ka pananglitan) Pipette 200 μl sa cell lysis master mix ngadto sa matag atabay, Balik-balik nga huyop 5-10 ka beses, Incubate sa lawak temperatura (20-25 ℃ ) alang sa 5 min.

Nota:Aron malikayan ang pagporma sa mga bula, palihug sa diha nga ang pipetting pipette nga sukdanan gipasibo ngadto sa 200μl o dili kaayo.Ang mga selula mahimong makita nga dag-um human sa lysis, nga normal.

4.(24 –well plate ingon nga usa ka panig-ingnan) gidugang sa liquid 20 μl Buffer ST (lain-laing mga sistema sa lysis Buffer ST gidugang sa usa ka kantidad nga gipakita sa Table 1-3), balik-balik nga pipetting 5-10 ka beses, sa lawak temperatura(20-25 ℃) gilumlom sa 2 min.

Nota:Ang tumoy sa pipette gibutang sa ilawom sa nawong, pagsiguro nga ang lysate gidugang,aron malikayan ang pagporma sa mga bula, palihug sa diha nga ang pipetting pipette scale gipasibo sa 200μl o dili kaayo.

Talaan 1-3:Idugang ang Buffer ST

5.Ang lysate gigamit alang sa sunod nga mga eksperimento sa RT-qPCR.Kung ang sunod nga mga eksperimento dili mahimo sa oras, palihug ibutang kini sa yelo nga dili molapas sa 2 ka oras, ug ibutang sa -20 ℃ o -80 ℃ (dili molapas sa tulo ka bulan).

B: Pag-andam sa sistema sa RT

1. Kuhaa ang 5 × Direct RT Mix ug ibutang kini sa usa ka ice bath, himoa nga kini natural nga matunaw, ug hinayhinay nga isagol kini alang sa ulahi nga paggamit;kuhaa ang RNase-Free ddH2O ug tunawon kini ug ibutang sa ice bath para magamit sa ulahi.Andama ang sistema sa reaksyon sa yelo sumala sa Talaan 2-1 sa ubos.

Talaan 2-1: Pag-andam sa RT reaction system

2. Human sa pagkompleto sa sistema pormulasyon, hinayhinay nga sinagol ug centrifuged sa makadiyot sa mosunod nga lamesa 2 -2 reaksyon kondisyon RT reaksyon.

Talaan 2-2: RT Reaction condition setting

3.Pagkahuman sa reaksyon, ang produkto sa reaksyon gibutang direkta sa yelo alang sa qPCR, palihug ibutang ang dugay nga pagpreserbar -20 ℃ o -80 ℃ .

Mubo nga sulat: Tungod sa paggamit sa non-purified template, puti nga precipitates mahimong makita sa reverse transcription nga produkto.Kini usa ka normal nga panghitabo.I-centrifuge dayon ang supernatant para sa sunod nga mga eksperimento.

Ang resulta nga RT reaction solution idugang sa sunod nga Lakang Real Time PCR reaction systems, girekomendar nga idugang ang kantidad gikan sa 10-30% sa reaction system.

C: Pag-andam sa sistema sa reaksyon sa qPCR

1. Angay nga kantidad sa B giandam sa lakang cDNA template sumala sa mosunod nga lamesa 3-1 sa pag-andam sa usa ka reaksyon nga sistema.

Mubo nga sulat: Ang kantidad sa cDNA template nag-asoy sa 10-30% sa qPCR system.Pananglitan, sa 20μl qPCR system, idugang ang 2-6 μl sa lysis buffer, apan dili labaw sa 6 μl.

2. Ang optimization maayo qPCR kondisyon (Annealing temperatura，etc.) alang sa qPCR reaksyon (Ang reaksyon kondisyon nga gihatag sa Table 3-2).

Mubo nga sulat: Sulayi ang paggamit sa labing maayo nga mga kondisyon alang sa mga reaksyon sa qPCR aron makakuha og mas maayo nga mga resulta.

Talaan 3-1: Pag-andam sa PCR reaction system

1*: Ang konsentrasyon sa primer mahimong ma-adjust sa han-ay nga 50-900 nM kung ang pasundayag sa primer nga reaksyon dili maayo.

Mubo nga sulat: Ang sistema sa qPCR mahimong ipasibo sumala sa mga panginahanglan sa eksperimento ug modelo sa fluorescence cycler.Para sa qPCR sa usa ka 50μl nga sistema, usba ang dosis sa reagent nga proporsyonal sumala sa 20μl sistema.

2*: Pilia ang angay nga katapusang konsentrasyon sa ROX Reference Dye sumala sa fluorescence quantitative thermal cycler.Ang labing angay nga ROX Reference Dye concentrations para sa kasagarang fluorescence quantitative cyclers gipakita sa table sa ubos:

Talaan 3-2: Ang mga kondisyon sa reaksyon sa qPCR gihatag

Mubo nga sulat: Aron makuha ang labing maayo nga qPCR nga epekto, ang gradient PCR mahimong magamit aron ma-optimize ang mga kondisyon sa reaksyon alang sa lainlaing mga template ug lainlaing mga primer.Ang mga kondisyon sa reaksyon sa PCR magkalainlain depende sa fluorescence analyzer, template, primer, ug uban pa. Sa piho nga operasyon, ang kamalaumon nga kondisyon sa reaksyon kinahanglan nga gidisenyo sumala sa piho nga mga kondisyon sa fluorescence quantitative thermal cycler, template type, gidak-on sa tipik sa interes, base sequence sa amplified fragment ug GC content ug gitas-on sa primers, lakip ang annealing temperature, reaction time, etc.

Tinuod nga Panahon nga mga prinsipyo sa disenyo sa primer sa PCR

Ipasa ang Primer ug Reverse Primer

Para sa Real Time PCR, ang primerong disenyo importante kaayo.Ang mga primer may kalabotan sa pagkasigurado ug kaepektibo sa PCR amplification, ug mahimong gidisenyo nga may kalabotan sa mosunod nga mga prinsipyo:

◆ Panguna nga gitas-on: 18-30bp.

◆ GC nga sulod: 40-60%.

◆ Tm nga bili: Primer design software, sama sa Primer 5, makahatag sa Tm value sa primer.Ang mga kantidad sa Tm sa upstream ug downstream primers kinahanglan nga duol sa mahimo.Ang pormula sa pagkalkula sa Tm mahimo usab nga gamiton: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Sa paghimo sa PCR, ang usa ka temperatura nga ubos sa primer Tm nga kantidad nga 5 °C kasagarang gipili isip annealing temperature (ang katugbang nga pagtaas sa annealing temperature mahimong makadugang sa specificity sa PCR reaction).

◆ Mga primer ug produkto sa PCR:

◆ Design primer PCR amplification produkto gitas-on mao ang labing maayo nga 100-150bp.

◆ Ang mga primerong disenyo sa sekondaryang bahin sa estruktura sa template kinahanglang likayan kutob sa mahimo.

◆ Likayi ang pagporma sa 2 o labaw pa nga komplementaryong base tali sa 3′ nga tumoy sa upstream ug downstream primers.

◆ Primer 3′ terminal base dili mahimong anaa sa 3 ka dugang nga sunodsunod nga G o C.

◆ Ang mga primer mismo dili adunay mga komplementaryong istruktura, kung dili usa ka istruktura sa hairpin ang maporma, nga makaapekto sa PCR amplification.

◆ Ang ATCG kinahanglang iapod-apod nga parehas kutob sa mahimo sa primer sequence, ug ang 3′ terminal base kinahanglang likayan isip T.

Apendise1:Cell DirektaRT-qPCR Kit nga sangkapt suplemento nga pakete

1.Cell Lysis Solution