Nahibal-an kaayo nga sa sentral nga dogma, ang RNA mao ang transkripsyon nga tigpataliwala tali sa DNA ug ekspresyon sa protina.Kung itandi sa pagkakita sa DNA, ang pagtuki sa RNA mahimong mas obhetibo nga magpakita sa ekspresyon sa gene sa mga organismo.Ang mga eksperimento nga naglambigit sa RNA naglakip sa: qRT-PCR, RNA-Seq, ug fusion gene detection, ug uban pa. Base sa mga kinaiya sa RNA mismo (ang singsing sa asukal sa RNA adunay usa pa ka libre nga hydroxyl nga grupo kay sa singsing sa asukal sa DNA), inubanan sa daghang gidaghanon sa mga RNases sa palibot, ang RNA mas dili lig-on ug dali nga madaot kaysa DNA.Basura sulod, basura gawas, kung ang kalidad sa RNA dili maayo, nan ang mga resulta sa eksperimento kinahanglan nga dili makatagbaw, ilabi na nga gipakita ingon nga dili tukma nga datos o dili maayo nga pag-usab.Busa, ang dugang nga pagtagad kinahanglan ibayad sa pagproseso sa RNA, ug ang sumpay sa pagkontrol sa kalidad mas importante usab aron maseguro ang katukma ug katukma sa sunod-sunod nga datos sa eksperimento.

Alang sa pagkontrol sa kalidad sa RNA, kasagaran adunay mga mosunod nga kasagarang gigamit nga mga pamaagi:

• Spectrophotometry
• agarose gel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• real-time nga fluorescent quantitative PCR
• Qubit fluorescent dye nga pamaagi

01 Spectrophotometry

Ang RNA adunay conjugated double bonds ug adunay absorption peak sa wavelength nga 260nm.Sumala sa balaod ni Lambert-Beer, makalkulo nato ang konsentrasyon sa RNA gikan sa absorption peak sa 260nm.Dugang pa, mahimo usab natong kuwentahon ang kaputli sa RNA sumala sa ratio sa 260nm, 280nm ug 230nm absorption peaks.Ang 280nm ug 230nm mao ang mga kinatumyan sa pagsuyup sa mga protina ug gagmay nga mga molekula, matag usa.Ang ratio sa A260/A280 ug A260/A230 sa qualified RNA purity kinahanglan nga mas dako pa kay sa 2. Kung kini ubos pa sa 2, kini nagpasabot nga adunay protina o gamay nga molekula nga kontaminasyon sa RNA sample ug kinahanglan nga putli pag-usab.Ang mga tinubdan sa kontaminasyon makaapektar sa mga eksperimento sa ubos, sama sa pagpugong sa episyente sa amplification sa mga reaksyon sa PCR, nga moresulta sa dili tukma nga mga resulta sa quantitative.Ang kaputli sa RNA adunay dako nga impluwensya sa sunod nga mga resulta, busa ang spectrophotometry sa kasagaran usa ka kinahanglanon nga link sa pagkontrol sa kalidad sa unang lakang sa mga eksperimento sa nucleic acid.

Figure 1. Kinaandan nga RNA/DNA Absorption Spectrum

02 Agarose gel electrophoresis

Gawas pa sa kaputli, ang integridad sa RNA usa usab sa hinungdanon nga mga timailhan alang sa paghukom sa kalidad sa RNA.Ang pagkadaot sa RNA mosangpot sa daghang mugbo nga mga tipik sa sample, busa ang gidaghanon sa mga tipik sa RNA nga epektibong mamatikdan ug matabonan sa reference sequence makunhoran.Ang integridad sa RNA mahimong masusi pinaagi sa electrophoresis sa kinatibuk-ang RNA sa usa ka 1% nga agarose gel.Kini nga paagi mahimo’g i-configure ang gel sa imong kaugalingon, o gamiton ang prefabricated E-Gel™ System alang sa pagsulay sa integridad.Labaw sa 80% sa kinatibuk-ang RNA mao ang ribosomal RNA, ang kadaghanan niini gilangkoban sa 28S ug 18S rRNA (sa mammalian system).Ang maayo nga kalidad nga RNA magpakita sa duha ka klaro nga mahayag nga mga bar, nga mao ang 28S ug 18S nga mahayag nga mga bar, matag usa, sa 5 Kb ug 2 Kb, ug ang ratio lagmit nga hapit sa 2: 1.Kung kini anaa sa usa ka diffuse nga estado, kini nagpasabut nga ang sample sa RNA mahimo’g nadaot, ug girekomenda nga gamiton ang pamaagi nga gihulagway sa ulahi aron masulayan pa ang kalidad sa RNA.

Figure 2. Pagtandi sa degraded (lane 2) ug intact RNA (lane 3) sa agarose gel electrophoresis

03 Agilent Bioanalyzer

Dugang pa sa agarose gel electrophoresis nga pamaagi nga gihulagway sa ibabaw, nga makatabang kanato sa pag-ila sa integridad sa RNA sa yano ug dali, mahimo usab natong gamiton ang Agilent bioanalyzer aron mahibal-an ang integridad sa RNA.Gigamit niini ang kombinasyon sa microfluidics, capillary electrophoresis, ug fluorescence aron masusi ang konsentrasyon ug integridad sa RNA.Pinaagi sa paggamit sa built-in nga algorithm aron analisahon ang profile sa sample sa RNA, ang Agilent bioanalyzer mahimong makalkulo sa usa ka reference RNA integrity value, RNA Integrity Number (gitawag nga RIN) [1].Kon mas dako ang bili sa RIN, mas taas ang integridad sa RNA (1 hilabihan ka degradado, 10 ang labing kompleto).Ang ubang mga eksperimento nga naglambigit sa RNA nagsugyot sa paggamit sa RIN isip usa ka parametro alang sa kalidad nga pagtasa.Ang pagkuha sa high-throughput sequencing nga mga eksperimento (gitawag dinhi nga NGS) isip usa ka pananglitan, ang mga giya sa Oncomine ™ Human Immune Repertoire, nga gigamit sa pag-detect sa B cell ug T cell antigen receptors sa Thermo Fisher's Oncomine panel series, nagsugyot nga ang mga sample nga adunay RIN values ​​labaw pa sa 4, Mas epektibo nga pagbasa ug clones mahimong masukod 3 (Figure).Adunay lain-laing girekomendar nga han-ay alang sa lain-laing mga panel, ug sa kasagaran ang usa ka mas taas nga RIN makadala sa mas epektibo nga data.

Figure 3, sa Oncomine™ Human Immune Repertoire nga mga eksperimento, ang mga sample nga adunay RIN nga labaw sa 4 makamatikod sa mas epektibo nga mga pagbasa ug T cell clones.【2】

Bisan pa, ang kantidad sa RIN adunay pipila nga mga limitasyon.Bisan tuod ang RIN adunay taas nga correlation sa kalidad sa NGS experimental data, kini dili angay alang sa FFPE samples.Ang mga sample sa FFPE dugay nang giatiman sa kemikal, ug ang gikuha nga RNA sa kasagaran adunay gamay nga kantidad sa RIN.Bisan pa, wala kini magpasabut nga ang epektibo nga datos sa eksperimento kinahanglan dili makatagbaw.Aron tukma nga masusi ang kalidad sa mga sample sa FFPE, kinahanglan namon nga mogamit mga sukod gawas sa RIN.Dugang sa RIN, ang Agilent bioanalyzer mahimo usab nga makalkula ang kantidad sa DV200 ingon usa ka parameter sa pagtimbang-timbang sa kalidad sa RNA.Ang DV200 usa ka parameter nga nagkalkula sa proporsyon sa mga tipik nga mas dako pa sa 200 bp sa usa ka sample sa RNA.Ang DV200 usa ka mas maayo nga timailhan sa kalidad sa sample sa FFPE kaysa RIN.Alang sa RNA nga gikuha sa FFPE, kini adunay taas kaayo nga correlation sa gidaghanon sa mga gene nga epektibo nga mamatikdan ug ang pagkalainlain sa mga gene [3].Bisan kung ang DV200 makahimo sa mga kakulangan sa kalidad nga pagkakita sa FFPE, ang Agilent bioanalyzer dili gihapon komprehensibo nga pag-analisar sa mga problema sa kalidad sa mga sample sa RNA, lakip na kung adunay mga inhibitor sa mga sample.Ang mga inhibitor mismo makaapektar sa kaepektibo sa amplification sa downstream nga mga eksperimento ug makapakunhod sa gidaghanon sa mapuslanong datos.Aron mahibal-an kung adunay usa ka tigpugong sa sample, mahimo naton gamiton ang tinuod nga oras nga fluorescent quantitative PCR nga pamaagi nga gihulagway sa sunod.

04 real-time nga fluorescent quantitative PCR

Ang tinuod nga panahon nga fluorescent quantitative PCR nga pamaagi dili lamang makamatikod sa mga inhibitor sa sample, apan tukma usab nga nagpakita sa kalidad sa RNA sa FFPE sample.Kung itandi sa Agilent biological analyzers, ang real-time nga fluorescence quantitative nga mga instrumento mas popular sa mga dagkong biological laboratories tungod sa ilang mas lapad nga aplikasyon.Aron masulayan ang kalidad sa mga sampol sa RNA, kinahanglan lang kitang mopalit o mag-andam sa mga primerong probe alang sa internal nga reference nga mga gene, sama sa GUSB (Cat no. Hs00939627).Pinaagi sa paggamit niini nga set sa mga primer, probes ug mga sumbanan (total nga RNA sa nahibal-an nga konsentrasyon) sa pagpahigayon sa hingpit nga quantitative nga mga eksperimento, ang epektibo nga RNA fragment konsentrasyon mahimong kalkulado ingon nga ang evaluation standard sa RNA kalidad (Functional RNA Quantitation (FRQ) sa mubo).Sa usa ka pagsulay sa NGS, among nahibal-an nga ang FRQ sa mga sample sa RNA adunay taas kaayo nga correlation sa epektibo nga gidaghanon sa datos.Para sa tanang sample nga mas dako pa sa 0.2ng/uL FRQ, labing menos 70% sa mga basahon ang epektibong makatabon sa reference sequence (Figure 4).

Figure 4, ang bili sa FRQ nga nakit-an sa fluorescence quantitative nga pamaagi adunay taas kaayo nga correlation (R2> 0.9) uban ang epektibo nga datos nga nakuha sa eksperimento sa NGS.Ang pula nga linya mao ang bili sa FRQ nga katumbas sa 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Dugang pa nga magamit sa mga sample sa FFPE, ang real-time nga quantitative nga pamaagi sa PCR mahimo usab nga epektibo nga ma-monitor ang mga inhibitor sa mga sample.Mahimo natong idugang ang sample nga makita sa sistema sa reaksyon nga adunay Internal Positive Control (IPC) ug ang Assay niini, ug dayon ipahigayon ang fluorescence quantification aron makuha ang Ct value.Kung ang kantidad sa Ct naa sa luyo sa kantidad sa Ct sa wala’y sample nga reaksyon, kini nagpakita nga ang tigpugong naa sa sample ug gipugngan ang pagkaayo sa amplification sa reaksyon.

05 Qubit fluorescent dye nga pamaagi

Ang Qubit Fluorometer mao ang labing sagad nga gigamit nga gamay nga aparato alang sa konsentrasyon sa nucleic acid ug pagtuki sa kaputli, nga dali nga magamit ug naa sa halos matag laboratoryo sa biology sa molekula.Sakto nga kalkulado niini ang konsentrasyon sa nucleic acid pinaagi sa pag-detect ug nucleic acid-binding fluorescent dye (Qubit detection reagent).Ang Qubit adunay taas nga pagkasensitibo ug espesipiko, ug tukma nga maihap ang RNA hangtod sa pg/µL nga konsentrasyon.Dugang pa sa ilado nga abilidad sa tukma nga pag-ihap sa konsentrasyon sa nucleic acid, ang pinakabag-ong modelo sa Thermo Fisher, Qubit 4.0, makamatikod usab sa integridad sa RNA.Ang Qubit 4.0's RNA detection system (RNA IQ Assay) nakamatikod sa integridad sa RNA pinaagi sa dungan nga pag-ila sa duha ka piho nga fluorescent dyes.Kining duha ka fluorescent dyes mahimong makagapos sa dagkong mga tipik ug gagmay nga mga tipik sa RNA, matag usa.Kining duha ka fluorescent dyes nagpakita sa proporsiyon sa dagkong mga tipik sa RNA sa sample, ug gikan niini ang IQ (Integridad ug Kalidad) nga bili nga nagrepresentar sa kalidad sa RNA mahimong kalkulado.Ang bili sa IQ magamit sa FFPE ug dili FFPE nga mga sampol, ug adunay dakong impluwensya sa sunodsunod nga kalidad sa pagkasunodsunod.Ang pagkuha sa mga eksperimento sa NGS isip usa ka panig-ingnan, sa RNA-Seq nga mga eksperimento sa pagsulay nga gihimo sa Ion torrent™ nga plataporma, kadaghanan sa mga sample nga adunay mga kantidad sa IQ nga labaw sa 4 adunay labing menos 50% nga epektibo nga pagbasa (Figure 5).Kung itandi sa nahisgutan sa ibabaw nga mga pamaagi sa pag-ila, ang Qubit IQ Assay dili lamang mas kombenyente sa pag-operate ug gamay ra ang oras (sa sulod sa lima ka minuto), apan adunay usab usa ka maayo nga correlation tali sa gisukod nga parameter nga IQ nga kantidad ug ang kalidad sa datos sa mga eksperimento sa ubos.

Figure 5, adunay usa ka dako nga correlation sa taliwala sa Qubit RNA IQ bili ug ang mapped nga basahon sa RNA-Seq.【5】

Pinaagi sa pasiuna sa ibabaw, nagtuo ako nga ang tanan adunay igo nga pagsabut sa lainlaing mga pamaagi sa pagkontrol sa kalidad sa RNA.Sa praktis, makapili kaang katugbang nga pamaagi sumala sa sampol nga tipo ug anaa na nga mga instrumento.Pinaagi lamang sa pagkontrolar sa kalidad sa RNA nga maayo nga atong malikayan ang kapakyasan sa sunod nga mga eksperimento tungod sa dili maayo nga kalidad sa sample, sa ingon makadaginot sa bililhong panahon, kusog ug gasto.

Mga produkto sa pakisayran:

Animal Total RNA Isolation Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

mga pakisayran

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.Ang RIN: usa ka numero sa integridad sa RNA alang sa pag-assign sa mga kantidad sa integridad sa mga pagsukod sa RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Gipauswag nga Sukatan sa Kalidad para sa Pagtimbang-timbang sa RNA nga Gikan sa Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 170, Issue 3, August 3https://doi.org/10.1093/toxsci/