1. Inisyal nga pagsabot

Niini nga yugto, kinahanglan natong masabtan ang pipila ka mga konsepto ug terminolohiya, aron malikayan nga masayop sa atubangan sa atong mga tigulang, sama sa:

P: Unsa ang kalainan tali sa RT-PCR, qPCR, Real-time nga PCR, ug real-time nga RT-PCR?

Tubag: Ang RT-PCR kay reverse transcription PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR), nga kaylap nga gigamit nga variant sa polymerase chain reaction (PCR).Sa RT-PCR, ang usa ka RNA strand gibalikbalik nga gi-transcribe ngadto sa komplementaryong DNA, nga gigamit isip usa ka template alang sa DNA amplification pinaagi sa PCR.
Real-time-PCR ug qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) pareho ra nga butang, ang duha mao ang real-time nga quantitative PCR, nga nagpasabot nga ang matag cycle sa PCR adunay real-time nga mga rekord sa datos, mao nga ang gidaghanon sa pagsugod nga mga templates mahimong ma-adjust sa tukma nga pagtuki.

Bisan tuod ang duha ka Real-time PCR (real-time fluorescent quantitative PCR) ug Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) daw gipamubo isip RT-PCR, ang internasyonal nga kombensiyon mao ang: Ang RT-PCR espesipikong nagtumong sa reverse transcriptionPCR , Ang tinuod nga panahon nga PCR kasagaran gipamubo isip qPCR (quantitative real-time PCR).

Ug real-time nga RT-PCR (RT-qPCR), Kini ang reverse transcription PCR nga gihiusa sa fluorescent quantitative nga teknolohiya: una pagkuha og cDNA (RT) gikan sa RNA reverse transcription, ug dayon gamita ang Real-time PCR alang sa quantitative analysis (qPCR).Kadaghanan sa mga laboratoryo naghimo sa RT-qPCR, nga mao, panukiduki bahin sa RNA expression down-regulation, mao nga ang qPCR nga gihisgutan sa tanan sa laboratoryo sa tinuud nagtumong sa RT-qPCR, apan ayaw kalimti nga adunay daghang mga pagsulay sa DNA sa mga aplikasyon sa klinika.Ang quantitative analysis, sama sa hepatitis B virus HBV detection.

Pangutana: Human mabasa ang daghang fluorescent quantitative PCR, nganong kinahanglan man nga kontrolahon ang gipadako nga tipik sulod sa range nga 80-300bp?

Tubag: Ang gitas-on sa matag pagkasunod-sunod sa gene lahi, ang uban pipila ka kb, ang uban gatosan ka bp, apan kinahanglan lang nato nga gikinahanglan ang gitas-on sa produkto nga 80-300bp sa dihang magdesinyo sa mga primer, mubo ra o dugay kaayo dili angay alang sa fluorescent quantitative PCR detection .Ang tipik sa produkto mubo ra kaayo aron mailhan gikan sa primer-dimer.Ang gitas-on sa primer-dimer maoy mga 30-40bp, ug lisod mailhan kon kini usa ka primer-dimer o produkto kon kini ubos pa sa 80bp.Kung ang tipik sa produkto taas kaayo, nga molapas sa 300bp, kini dali nga mosangpot sa ubos nga pagkaayo sa amplification ug dili epektibo nga makamatikod sa gidaghanon sa gene.

Pananglitan, kung mag-ihap ka kung pila ang naa sa usa ka klasehanan, kinahanglan nimo nga ihap kung pila ang mga baba.Tinuod usab kini kung makit-an nimo ang mga gene, kinahanglan nimo nga makit-an ang usa ka piho nga pagkasunod-sunod sa usa ka gene aron magrepresentar Ang tibuuk nga pagkasunod-sunod buhaton.Kung gusto nimong ihap ang mga tawo, kinahanglan nimo nga ihap ang mga baba ug ilong, dunggan, ug baso, ug dali nga masayop.

Aron mapalapad, sa biolohikal nga panukiduki, adunay daghang mga kaso sa panukiduki gikan sa punto hangtod sa lugar, tungod kay ang pagkasunud-sunod sa gene sa bisan unsang mga espisye taas kaayo, dili kinahanglan ug imposible nga sukdon ang tanan nga mga tipik, sama sa pagkasunod-sunod sa bakterya 16S, nga mao ang paghimo sa konserbatibo nga pagkasunod-sunod sa bakterya Pagsusi aron mahibal-an ang gidaghanon sa usa ka piho nga populasyon sa bakterya.

Q: Unsa ang labing maayo nga gitas-on alang sa qPCR primer nga disenyo?

Tubag: Sa kinatibuk-an nga pagsulti, ang primer nga gitas-on mga 20-24bp, nga mas maayo.Siyempre, kinahanglan natong hatagan ug pagtagad ang bili sa TM sa primer sa dihang magdesinyo sa primer, tungod kay kini may kalabutan sa kamalaumon nga temperatura sa annealing.Pagkahuman sa daghang mga eksperimento, napamatud-an nga ang 60 ° C usa ka mas maayo nga kantidad sa TM.Kung ang temperatura sa annealing ubos kaayo, kini dali nga mosangpot sa dili piho nga pagpadako.Kung ang temperatura sa annealing taas kaayo, ang kahusayan sa amplification mahimong medyo ubos, ang peak sa amplification curve magsugod sa ulahi, ug ang CT nga kantidad malangan.

P: Sa unsang paagi lahi ang pamaagi sa tina sa pamaagi sa pagsusi?

Tubag: Pamaagi sa tinaAng ubang mga fluorescent dyes, sama sa SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ug uban pa, dili mobuga ug kahayag sa ilang kaugalingon, apan mopagawas sa fluorescence human mabugkos sa menor de edad nga groove sa double-stranded DNA.Busa, sa sinugdanan sa reaksyon sa PCR, ang makina dili makamatikod sa fluorescent signal.Sa diha nga ang reaksyon makaabot sa annealing-extension stage, ang double strand giablihan, ug ang usa ka bag-ong strand gi-synthesize ubos sa aksyon sa DNA polymerase, ug ang fluorescent molecule nagbugkos sa dsDNA minor groove.Samtang nagkadaghan ang mga siklo sa PCR, nagkadaghan ang mga tina nga gikombinar sa double-stranded nga DNA, ug ang fluorescent signal padayon usab nga gipauswag.Ang paagi sa pagtina kay gigamit sa siyentipikong panukiduki.
PS: Pag-amping sa paghimo sa eksperimento, ang tina kinahanglan nga ikombinar sa DNA sa tawo, pag-amping nga mahimo kini nga fluorescent nga tawo.

Pamaagi sa pagtina (wala) Pamaagi sa pagsusi (tuo)
PS: Pag-amping sa paghimo sa eksperimento, ang tina kinahanglan nga ikombinar sa DNA sa tawo, pag-amping nga mahimo kini nga fluorescent nga tawo.

Ang SYBR Green Ⅰ nagbugkos sa gamay nga lihok sa DNA

Pamaagi sa pagsusiAng Taqman probe mao ang labing kasagarang gigamit nga hydrolysis probe.Adunay usa ka fluorescent nga grupo sa 5′ nga katapusan sa probe, kasagaran FAM, ug ang probe mismo usa ka han-ay nga komplementaryo sa target nga gene.Adunay usa ka fluorescent quenching nga grupo sa 3′ katapusan.Sumala sa prinsipyo sa pagbalhin sa enerhiya sa reortansya (Förster Resoronce Energy Transfer, ug ang pag-undang sa molekula sa Truorescent (7-11NEL Fluorescent Grouper (7-11Tor Fluorescent Groupcent), ang pag-undang sa molekula sa Truorescent (7-11Tor Fluorescent Procual), ang pag-undang sa molekula sa Truorescent), ang pag-undang sa molekula sa Truorescent (7-13Tor Fluorescent Groupercent), ang pag-undang sa molekula nga molutaw (7-11Tor nga molekrak samtang ang Autofluorescence naluya.Busa, sa sinugdanan sa reaksyon sa PCR, kung ang pagsusi libre ug wala'y sulod sa sistema, ang tigbalita nga fluorescent nga grupo dili mopagawas sa fluorescence.Kung mag-annealing, ang primer ug probe magbugkos sa template.Atol sa yugto sa extension, ang polymerase padayon nga nag-synthesize sa bag-ong mga kadena.Ang DNA polymerase adunay 5′-3′ exonuclease nga kalihokan.Sa pag-abot sa probe, ang DNA polymerase mag-hydrolyze sa probe gikan sa template, ibulag ang reporter fluorescent group gikan sa quencher fluorescent group, ug buhian ang fluorescent signal.Tungod kay adunay usa-sa-usa nga relasyon tali sa probe ug sa template, ang pamaagi sa pagsusi mas labaw sa pamaagi sa tina sa mga termino sa katukma ug pagkasensitibo sa pagsulay.Ang pamaagi sa pagsusi kasagarang gigamit sa pagdayagnos.

Q: Unsa ang absolute quantification?Unsa ang Relative Quantification?

Tubag: Ang hingpit nga quantification nagtumong sa kalkulasyon sa inisyal nga numero sa kopya sa sample nga sulayan sa qPCR, sama sa kung pila ka HBV virus ang anaa sa 1ml sa dugo.Ang resulta nga nakuha pinaagi sa relatibong quantification mao ang pagbag-o sa gidaghanon sa target nga gene sa usa ka espesipikong sample nga may kalabotan sa laing reference sample, ug ang gene expression kay up-regulated o down-regulated.

P: Ang gidaghanon ba sa RNA extraction, reverse transcription efficiency, ug amplification efficiency makaapekto sa experimental nga mga resulta?
P: Makaapekto ba ang sample storage, extraction reagents, reverse transcription reagents, ug light-transmitting consumables sa mga resulta sa eksperimento?
P: Unsang paagiha ang makatul-id sa eksperimento nga datos?

Mahitungod niini nga mga isyu, among ihulagway kini sa detalye sa mga advanced ug advanced nga mga seksyon sa ubos.
2. Abanteng kahibalo

Mahitungod sa real-time nga fluorescent quantitative PCR, kinahanglan natong ilhon ang kamatuoran nga liboan ka siyentipikong research paper ang gipatik kada tuig, diin ang fluorescent quantitative PCR nga teknolohiya dili gamay nga numero.

Kung walay komon nga sumbanan sa pagsukod sa fluorescent quantitative PCR nga eksperimento, ang mga resulta mahimong magkalahi kaayo.Alang sa parehas nga gene sa parehas nga espisye, nga adunay parehas nga pamaagi sa pagproseso, ang mga resulta sa pag-ila usab magkalainlain, ug maglisud alang sa mga naulahi nga mag-uli sa parehas nga mga resulta.Ikaw Walay nakahibalo kon asa ang husto ug unsa ang sayop.

Nagpasabot ba kini nga ang fluorescent quantitative PCR usa ka cheat technology o dili kasaligan nga teknolohiya?Dili, kini tungod kay ang fluorescent quantitative PCR mas sensitibo ug mas tukma, ug ang gamay nga sayup nga operasyon makahimo og hingpit nga kaatbang nga mga resulta.Ang usa ka gamay nga kapildihan usa ka libo ka milya ang gilay-on.Ang tagsulat sa artikulo mahimong balik-balik nga gitortyur sa mga tigrepaso.Sa parehas nga oras, ang mga tigrepaso sa journal lisud usab nga mopili gikan sa lainlaing mga resulta sa eksperimento.

Sa tanan, nagpunting sa kakulang sa consensus sa real-time nga mga eksperimento sa PCR.Alang niini, ang mga senior nga siyentipiko sa industriya nagsugod sa paghimo og mga sumbanan,nagkinahanglan sa mga kontribyutor sa paghatag sa pipila ka gikinahanglan nga mga detalye sa eksperimento ug pagproseso sa datos (lakip ang gikinahanglan nga datos) sa artikulo aron makab-ot kini nga mga sumbanan .

Ang mga tigrepaso makahukom sa kalidad sa eksperimento pinaagi sa pagbasa niini nga mga detalye;Ang umaabot nga mga magbabasa mahimo usab nga mogamit niini aron masubli ang eksperimento o mapaayo ang eksperimento.Dayon ang mga resulta sa eksperimento nga nakuha niining paagiha puno sa impormasyon, taas nga kalidad, ug magamit.

MIBBI (Minimum nga Impormasyon alang sa Biological ug Biomedical Investigations -http://www.mibbi.org) namugna.Ang MIBBI usa ka proyekto nga naghatag mga sumbanan alang sa mga eksperimento.Gimantala kini sa kinaiyahan.Kini nga proyekto gitumong sa nagkalain-laing biolohikal nga mga eksperimento, lakip na ang cell biology, Microarray, qPCR nga atong hisgotan karon, ug uban pa, ug naghatag alang sa matag matang sa eksperimento sa pagsumite sa mga manuskrito.Ang maong impormasyon kinahanglang ihatag sa tanang panahon.

Sa proyekto sa MIBBI, adunay duha ka artikulo nga may kalabutan sa fluorescent quantitative PCR, nga mao:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – usa ka structured nga pinulongan ug giya sa pagtaho alang sa real-time quantitative PCR data;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimum nga impormasyon para sa pagpatik sa mga artikulo mahitungod sa real-time quantitative PCR experiments.
Una, maghisgot kita bahin sa RDML, ang detalye sa terminolohiya.

Kung walay standard definition alang sa tanan, imposible nga ipadayon ang diskusyon, mao nga ang pagpatin-aw sa mga termino importante kaayo sa eksaminasyon.
Ang terminolohiya nga gigamit sa fluorescent quantitative PCR experiment naglakip sa mosunod nga sulod.Ang QIAGEN naghimo sa labing kaayo nga summary alang kanamo.Ang mga musunod kay uga ang tananmga butang .

Kurba sa amplification
Ang amplification curve nagtumong sa curve nga gihimo sa panahon sa proseso sa PCR, nga ang cycle number isip abscissa ug ang real-time nga fluorescence intensity atol sa reaksyon isip ordinate.

Ang usa ka maayo kaayo nga amplification curve kinahanglan adunay mga mosunod nga mga kinaiya: ang baseline patag o gamay nga mikunhod, ug walay klaro nga pataas nga uso;ang inflection point sa curve klaro, ug ang slope sa exponential phase kay proporsyonal sa amplification efficiency.Ang mas dako nga bakilid, ang mas taas nga amplification efficiency;ang kinatibuk-ang amplification curve Ang parallelism maayo, nga nagpakita nga ang amplification efficiency sa matag tubo parehas;dayag ang exponential phase sa amplification curve sa ubos nga konsentrasyon nga mga sample.

Baseline (Baseline)
Ang baseline mao ang lebel sa kasaba sa sayo nga siklo, kasagaran gisukod tali sa ika-3 ug ika-15 nga siklo, tungod kay ang pagtaas sa kantidad sa fluorescence nga gipahinabo sa produkto sa amplification dili mamatikdan niining panahona.Ang gidaghanon sa mga siklo nga gigamit sa pagkalkulo sa baseline mahimong lainlain ug mahimong kinahanglan nga pakunhuran kung ang taas nga kantidad sa template gigamit o kung ang lebel sa ekspresyon sa target nga gene taas.

Ang pagtakda sa baseline nagkinahanglan sa pagtan-aw sa fluorescence data gikan sa linearity amplification curve.Ang baseline gitakda aron ang pagtubo sa amplification curve magsugod sa usa ka cycle number nga mas dako pa kay sa baseline cycle top number.Ang mga baseline kinahanglan nga itakda sa tagsa-tagsa alang sa matag target nga han-ay.Ang kasagaran nga mga kantidad sa fluorescence nga nakit-an sa sayo nga mga siklo kinahanglan nga ibawas gikan sa mga kantidad sa fluorescence nga nakuha sa mga gipadako nga produkto.Ang pinakabag-o nga mga bersyon sa nagkalain-laing Real-Time PCR software nagtugot sa awtomatik nga pag-optimize sa baseline settings alang sa indibidwal nga mga sample.

Atol sa unang pipila ka mga siklo sa PCR amplification reaksyon, ang fluorescence signal dili kaayo mausab.Ang pagduol sa usa ka tul-id nga linya gitawag nga baseline, apan kung atong tan-awon pag-ayo ang unang pipila ka mga siklo, atong makita nga sulod sa baseline mao ang nahitabo sa hulagway sa ubos.

Background Background nagtumong sa
ang dili piho nga fluorescence nga kantidad sa reaksyon.Pananglitan: inefficient fluorescence quenching;o daghang gidaghanon sa double-stranded DNA templates tungod sa paggamit sa SYBR Green.Ang mga sangkap sa background sa signal gitangtang sa matematika pinaagi sa Real-Time PCR software algorithm.

Signal sa reporter
Ang signal sa reporter nagtumong sa fluorescent signal nga gihimo sa SYBR Green o fluorescently labeled sequence-specific probes atol sa Real-Time PCR.

Normalized Reporter Signal (RN)
Ang RN nagtumong sa fluorescence intensity sa reporter dye nga gibahin sa fluorescence intensity sa passive reference dye nga gisukod sa matag siklo.

Passive Reference Dye
Sa pipila ka mga Real-Time nga PCR,ang fluorescent dye ROX gigamit isip internal reference aron ma-normalize ang fluorescent signal.Gitul-id niini ang mga kabag-ohan tungod sa dili tukma nga pagpipet, posisyon sa atabay, ug pag-usab-usab sa fluorescence sa usa ka maayo nga basehan.

Ang fluorescence threshold (threshold)
gipasibo sa ibabaw sa background nga bili ug sa kamahinungdanon ubos sa plateau bili sa amplification curve.Kini kinahanglan nga nahimutang sa linear nga rehiyon sa amplification curve, nga nagrepresentar sa log-linear range sa PCR detection.Kinahanglang ibutang ang mga threshold sa log-amplification curve view aron ang log-linear phase sa PCR dali nga mailhan.Kung adunay daghang target nga mga gene sa Real-Time PCR, ang threshold kinahanglang itakda para sa matag target .Kasagaran, ang fluorescence signal sa unang 15 ka siklo sa PCR reaction gigamit isip fluorescence background signal, ug ang fluorescence threshold mao ang 10 ka beses nga standard deviation sa fluorescence signal sa unang 3 ngadto sa 15 cycle sa PCR, ug ang fluorescence threshold gitakda sa exponential phase sa PCR amplification.Sa kinatibuk-an, ang matag instrumento adunay iyang fluorescence threshold nga gitakda sa dili pa gamiton.

Cycle Threshold (CT) o Crossing Point (CP)
Ang cycle diin ang amplification curve mitabok sa threshold (ie, ang punto diin ang fluorescence detection motaas pag-ayo).Ang CT mahimong usa ka tipik ug ang kantidad sa pagsugod nga template mahimong kalkulado.Ang CT value nagrepresentar sa gidaghanon sa mga cycle nga nasinati kung ang fluorescent signal sa matag PCR reaction tube moabot sa set threshold.Adunay usa ka linear nga relasyon tali sa CT nga kantidad sa matag template ug ang logarithm sa inisyal nga numero sa kopya sa template, angmas taas ang inisyal nga numero sa kopya, mas gamay ang CT value, ug vice versa.Ang usa ka standard nga kurba mahimo pinaagi sa paggamit sa usa ka sumbanan nga adunay nahibal-an nga inisyal nga numero sa kopya, diin ang abscissa nagrepresentar sa kantidad sa CT, ug ang ordinate nagrepresentar sa logarithm sa inisyal nga numero sa kopya.Busa, basta makuha ang kantidad sa CT sa wala mailhi nga sample, ang inisyal nga numero sa kopya sa sample mahimong kalkulado gikan sa standard curve.

ΔCT nga bili
ΔCT nga bili naghulagwayang kalainan tali sa target nga gene ug sa katugbang nga endogenous reference gene CT nga bili, sama sa housekeeping gene, ug gigamit aron ma-normalize ang gidaghanon sa template nga gigamit:
⇒ΔCT = CT (target nga gene) - CT (endogenous reference gene)

ΔΔCT Bili
Ang ΔΔCT value naghulagway sa kalainan tali sa mean ΔΔCT value sa usa ka sample sa interes (eg, stimulated cells) ug ang mean ΔΔCT value sa usa ka reference sample (eg, unstimulated cells).Ang reference sample gitawag usab nga calibration sample ug ang tanan nga ubang mga sample kay na-normalize niini para sa relative quantification:
⇒ΔΔCT = average nga ΔCT (sample sa interes) - average nga ΔCT (reference sample)

Endogenous reference genes (endogenous reference genes)
Ang lebel sa ekspresyon sa endogenous reference genes, sama sa housekeeping genes (housekeeping genes), wala magkalahi tali sa mga sample.Ang pagtandi sa CT values ​​sa reference gene ngadto sa target gene nagtugot sa expression level sa target gene nga ma-normalize sa gidaghanon sa input RNA o cDNA (tan-awa ang seksyon sa ΔCT values ​​sa ibabaw).

Ang internal nga reference genes husto alang saposible nga RNA degradation o ang presensya sa enzyme inhibitors sa RNA samples, ingon man ang mga variation sa RNA content, reverse transcription efficiency, nucleic acid recovery, ug sample handling.Aron mapili ang (mga) labing maayo nga reperensiya nga gene, giusab namo ang algorithm aron tugotan ang pagpili niini sa labing maayo nga reperensiya nga nagsalig sa setting sa eksperimento.

Internal nga kontrol
Usa ka han-ay sa pagkontrol nga gipadako sa parehas nga reaksyon sa target nga han-ay ug gisusi sa usa ka lahi nga pagsusi (ie, paghimo og duplex PCR).Ang mga internal nga kontrol kanunay nga gigamit aron isalikway ang mga napakyas nga pagpadako, sama sa kung ang target nga han-ay wala makit-an.
Sample sa Calibration
Usa ka sampol nga pakisayran (pananglitan, giputli nga RNA gikan sa linya sa selula o tisyu) nga gigamit sa relatibong quantification aron itandi ang tanan nga ubang mga sample aron mahibal-an ang relatibong lebel sa ekspresyon sa usa ka gene.Ang sampol sa pag-calibrate mahimong bisan unsang sample, apan kasagaran usa ka kontrol (pananglitan, usa ka wala matambalan nga sample o usa ka sample gikan sa oras nga zero sa eksperimento).

Positibo nga mga kontrol
gamita ang mga reaksyon sa pagkontrol sanahibal-an nga kantidad sa template.Ang mga positibo nga kontrol kanunay nga gigamit aron masusi nga ang usa ka primer set o primer-probe set nagtrabaho sa husto ug nga ang reaksyon gipahimutang sa husto.

Walay Template Control (NTC)
Usa ka kontrol nga reaksyon nga naglangkob sa tanan nga gikinahanglan nga mga sangkap sa amplification reaksyon gawas sa template, nga kasagaran gipulihan sa tubig.Ang paggamit sa NTC mahimong makit-an ang kontaminasyon nga gipahinabo sa kontaminasyon sa reagent o langyaw nga DNA, sa ingon nagsiguro sa pagkatinuod ug kasaligan sa datos sa pagkakita.Ang pagpadako sa kontrol sa NTC nagpaila sa kontaminasyon.

Walay RT control (NRT)
Ang proseso sa pagkuha sa RNA mahimong adunay nahabilin nga genomic DNA, nga labi ka makadaot ug mao ang hinungdan nga nakaapekto sa kalidad sa datos ug ang natural nga kaaway sa qPCR, mao nga kung magdesinyo sa mga eksperimento, kinahanglan kini nga gidisenyo aron mapadako lamang ang pagtuki sa RNA.Adunay duha ka mga paagi, ang usa mao ang pagdesinyo sa mga primer sa mga intron, ang lain mao ang hingpit nga pagtangtang sa DNA, kung diin ang usa mas maayo, nga hisgutan sa ulahi.Ang kontrol sa NTR usa ka salamangka nga salamin aron mahibal-an ang polusyon sa DNA.Kung adunay amplification, nagpasabot nga adunay polusyon.

Mga sumbanan
Ang mga sumbanan mao ang mga sample sa nahibal-an nga konsentrasyon o numero sa kopya nga gigamit sa paghimo sa usa ka standard nga kurba.Aron masiguro ang kalig-on sa sumbanan, ang tipik sa gene kasagarang gi-clone sa plasmid ug gigamit ingon nga sumbanan.

Ang standard nga kurba
kasagaran lasaw ngadto sa labing menos 5 konsentrasyon gradients uban sa standard nga produkto sumala sa pagdoble ratio, ug 5 puntos nga madani sa mga coordinate sa CT bili ug kopya numero, ug ang mga punto konektado sa pagporma sa usa ka linya sa pagmugna sa usa ka standard curve.Alang sa matag sumbanan nga kurba, ang pagkabalido niini kinahanglan nga susihon.Ang bili sa bakilid nahulog tali sa -3.3 ug -3.8, ug ang matag konsentrasyon gihimo sa triplicate.Ang mga punto nga lahi kaayo sa ubang mga punto kinahanglan nga isalikway.Ang kantidad sa CT sa sample nga sulayan gidala sa standard curve, ug ang lebel sa ekspresyon sa sample nga sulayan mahimong makalkula.

Ang CT nga kantidad sa sample nga sulayan gidala sa standard curve, ug ang inisyal nga numero sa kopya sa sample nga sulayan mahimong kalkulado.

Efficiency ug Slope
Ang bakilid sa standard curve nagrepresentar sa kaepektibo sa real-time nga PCR.
· Ang usa ka bakilid nga -3.322 nagpakita nga ang PCR amplification efficiency mao ang 1, o 100% episyente, ug ang gidaghanon sa PCR nga produkto doble sa matag cycle.
· Ang usa ka bakilid nga ubos sa -3.322 (pananglitan, -3.8) nagpakita sa usa ka kahusayan sa PCR
·Ang usa ka bakilid nga mas dako pa kay sa –3.322 (eg, –3.0) nagpakita nga ang PCR efficiency daw mas labaw pa kay sa 100%, nga talagsaon, sa unsa nga paagi nga ang usa ka cycle sa PCR makamugna labaw pa kay sa doble sa amplified produkto?Kini nga sitwasyon mahitabo sa non-linear nga bahin sa PCR reaksyon, nga mao, adunay usa ka dako nga kantidad sa non-specific amplification.

pagkatunaw nga kurba
Human makompleto ang qPCR amplification, ang produkto sa PCR gipainit.Sa pagtaas sa temperatura, ang double-stranded amplification nga produkto anam-anam nga matunaw, nga moresulta sa pagkunhod sa fluorescence intensity.Kung maabot ang usa ka temperatura (Tm), daghang mga produkto ang matunaw.Ang fluorescence mikunhod pag-ayo.Ang lainlaing mga produkto sa PCR adunay lainlaing mga kantidad sa Tm ug lainlaing mga temperatura sa pagtunaw, aron mahibal-an ang pagkasigurado sa PCR.

Kurba sa pagkatunaw (derivative curve)
Ang curve sa pagtunaw gikuha aron maporma ang usa ka peak nga mapa, nga mahimo nga mas intuitive nga ipakita ang kahimtang sa mga tipik sa produkto sa PCR.Tungod kay ang temperatura sa pagtunaw mao ang Tm value sa DNA fragment, ang pipila ka mga parameter nga makaapekto sa Tm value sa DNA fragment mahimong mahukman, sama sa gidak-on sa tipik, GC content, ug uban pa.ang gitas-on sa gipadako nga produkto anaa sa han-ay sa 80-300bp, mao nga ang temperatura sa pagtunaw kinahanglan nga tali sa 80 °C ug 90 °C.

Paghubad sa curve sa pagtunaw: Kon ang bugtong nag-unang peak makita sa taliwala sa 80°C-90°C, kini nagpasabot nga ang fluorescent quantitative PCR mao ang hingpit;kung ang nag-unang peak makita tali sa 80°C-90°C ug ang lain-laing mga taluktok makita ubos sa 80°C, ang primer dimer kay batakan nga gikonsiderar.Mahimo nimong sulayan nga madugangan ang temperatura sa annealing aron masulbad kini;kon ang nag-unang peak makita sa taliwala sa 80°C-90°C, ug ang lain-laing peak makita pag-usab sa diha nga ang temperatura mosaka, kini batakan giisip nga adunay DNA kontaminasyon, ug DNA kinahanglan nga tangtangon sa inisyal nga yugto sa eksperimento.

Siyempre, aduna gihapoy pipila ka abnormal nga mga sitwasyon, nga bungkagon sa usa-usa sa ubos.
3. Abanteng kahibalo

Aron mahimo ang qPCR, kinahanglan kong isulti ang MIQE,Minimum nga Impormasyonpara sa Publikasyon saquantitativeReal-Time nga PCRMga eksperimento —ang minimum nga impormasyon para sa pagpatik sa mga artikulo bahin sa real-time quantitative PCRmga eksperimento.Aron mapasayon ​​ang pagsabot sa tanan, atong pasimplehon ang mahinungdanong sulod.

Mahimo nimong pangitaon ang orihinal nga teksto sa MIQE sa Internet, ug ang labing hinungdanon nga butang mao nga gitakda niini angchecklist sa datos nga kinahanglang ihatag sa dihang magmantala ug artikulo .

Ang mga tigrepaso makahukom sa kalidad sa eksperimento pinaagi sa pagbasa niini nga mga detalye;Ang umaabot nga mga magbabasa mahimo usab nga mogamit niini aron masubli o mapaayo ang eksperimento.
Angay nga hinumdoman nga sa kini nga lista, ang kamahinungdanon sa matag lista gimarkahan sa E o D matag usa.Unsay buot ipasabot niini?E: importante nga impormasyon (kinahanglan isumiter);D: tilinguhaong impormasyon (paghatag kutob sa mahimo).

MIQE (1)—Eksperimento nga Disenyo
Daghang mga scumbags nga nakakompleto sa ilang depensa pagkahuman sa ilang graduate nga mga pagtuon dili mahibal-an kung giunsa ang pagdesinyo sa usa ka eksperimento nga independente, ablihan ang ilang mga notebook, ug buhaton kung unsa ang gisulti sa magtutudlo nga ilang buhaton.Ingon usa ka sangputanan, ang eksperimento nga disenyo dili estrikto, ug ang departamento sa editoryal sa magasin miingon nga gusto nila nga himuon kini nga litrato ug kana nga litrato, mao nga gibuhat nila kini nga wala’y kapuslanan.Ingon niini ang paghimo sa mga scumbags!

Mas duol sa balay, ang unang prinsipyo sa eksperimento mao ang pagtinoang kalig-on sa eksperimento nga lohika.Ang labing sukaranan nga butang mao ang eksperimento nga disenyo, ug ang labing importante nga butang mahitungod sa eksperimental nga disenyo mao ang paagi sa pagtakda sa target nga sample, reference sample (kontrol), ug ang gidaghanon sa mga pagbalik-balik, aron ang eksperimental nga datos mahimong pakisayran, ikatandi, ug makapakombinsir.

Ang target nga samplenagtumong sa sample nga nagkinahanglan kanato sa pag-ila sa target nga gene human sa usa ka piho nga pagtambal.Ang sampol nga pakisayranmao ang sample nga walay bisan unsa nga pagtambal, nga sagad gitawag nga wild type sa biology.

Eksperimento nga mga replikaimportante kaayo.Sa kinatibuk-an, ang gidaghanon sa makapadani nga mga replika kinahanglan labaw pa sa tulo.Kinahanglan nga mailhan kung unsa ang biolohikal nga pagkopya ug unsa ang teknikal nga pagkopya.

Mga Replika sa Biyolohikal: Ang parehas nga eksperimento sa pag-verify nga gihimo sa lainlaing mga materyales (oras, mga tanum, mga batch, mga plato sa reaksyon).

Biological nga pagdoble
Atong himoon nga pananglitan ang pagtambal sa pestisidyo sa sili.Gusto namon nga mag-spray og mga pestisidyo sa tulo ka mga tanum sa ABC, unya ang tulo ka mga tanum sa ABC mao ang tulo ka biolohikal nga mga replikasyon, ug sila parehas nga eksperimento sa pag-verify nga gihimo sa lainlaing mga materyales.Apan isip usa ka eksperimento, gikinahanglan gyud ang usa ka kontrol, aron atong ma-spray ang usa sa mga sanga sa tanum A aron maporma ang usa ka eksperimento nga grupo sa tanum A, ug dili i-spray ang ubang mga sanga sa tanum A aron maporma ang usa ka kontrol nga grupo.Buhata ang sama alang sa B ug C.

Mga Teknikal nga Replika (Mga Teknikal nga Replika): Kini usa ka balik-balik nga eksperimento nga gidisenyo aron malikayan ang mga sayup nga gipahinabo sa operasyon, nga sa tinuud usa ka doble nga lungag nga gilakip sa parehas nga materyal.Ang mga pagtambal ug mga kontrol kinahanglan nga adunay mga replicate setting (minimum tulo) sa target nga gene ug sa internal nga reference gene.

Teknikal nga pagbalik-balik
Himoa nga pananglitan pag-usab ang sili nga gitambalan sa mga pestisidyo.Para sa eksperimento nga grupo sa tanom A, naghimo kami ug tulo ka PCR hole nga 1, 2, ug 3 para sa iyang target nga gene ug internal reference gene matag usa, aron makuha ang average human sa detection.Alang sa pagkontrol sa tanum A Ang mga grupo gitratar usab sa parehas nga paagi.Sa susama, buhata ang parehas nga pagtambal alang sa mga tanum nga B ug C.Kini usa ka teknikal nga pagbalik-balik.

Angay nga timan-an kanaunsa ang mosulod sa statistics mao ang biolohikal nga pagbalik-balik, ug ang teknikal nga pagbalik-balik mao ang pagsulay kon adunay bisan unsa nga random phenomena sa eksperimento nga proseso, aron sa paghimo sa mga eksperimento nga mga resulta katuohan, nga mao, sa paglikay sa mga sayop pinaagi sa pagkuha sa ilang mga average sama sa kanunay natong isulti.

Negatibo nga mga Kontrol—NTC ug NRT
NTC (Walay-Template Control), usa ka kontrol nga walay template, gigamit sa pagmatuod kon kontaminado ba ang eksperimento nga materyal.Kasagaran, ang tubig gigamit ingon usa ka template.Kung adunay usa ka fluorescent nga reaksyon, kini nagpakita nga ang nucleic acid kontaminasyon nahitabo sa laboratoryo.

Kini nga mga polusyon gikan sa: dili putli nga tubig, dili kwalipikado nga mga reagents nga adunay sulud nga endogenous DNA, primer nga polusyon, polusyon sa kagamitan sa laboratoryo, polusyon sa aerosol, ug uban pa, kinahanglan nga mogamit sa RNase scavengers ug RNase inhibitors.Ang polusyon sa aerosol mao ang labing lisud nga pangitaon.Hunahunaa nga ang imong laboratoryo sama sa aso, nga adunay lainlaing mga nucleic acid nga gisuspinde sa hangin.

NRT (No-Reverse Transcriptase), ang kontrol nga walay reverse transcription, mao ang non-reverse transcribed RNA isip negatibo nga kontrol, nga mao ang pagkontrol sa gDNA residue.

Sa paghimo sa ekspresyon sa gene, ang gidaghanon sa RNA makita pinaagi sa pag-ila sa gidaghanon sa cDNA human sa reverse transcription.Kung adunay nahabilin nga gDNA kung giputli ang RNA, kini ang hinungdan sa mga sayup sa mga resulta sa eksperimento, tungod kay ang aktwal nga mga resulta nga nakuha mao ang gDNA ug cDNA.Sa aggregate level, dili lang cDNA, ang gDNA kinahanglang bug-os nga tangtangon atol sa RNA extraction.

MIQE (2)—sampol nga impormasyon
Ang gitawag nga sampol nga impormasyon nagpasabut nga kung magmantala kami usa ka artikulo bahin sa qPCR, kinahanglan namon nga ipatin-aw ang sampol nga kasayuran, nga usa ka kinahanglanon nga bahin sa artikulo.Sa susama, kung magproseso kami sa mga sample, kinahanglan usab namon nga i-regulate ang among kaugalingon nga mga operasyon aron masiguro ang pagkabalido sa mga sample.

Ang paghulagway sa sample resulta lamang, ug kinahanglan natong hatagan ug dugang pagtagad ang mga materyales nga gikuha atol sa tibuok nga eksperimento.

Pagpili sa eksperimento nga mga materyales
Mga sample sa dugo – pilia ang lab-as nga dugo, dili molapas sa 4 ka oras.Mga sample sa cell – pilia ang pagkolekta ug presko nga mga selula sa panahon sa kusog nga pagtubo.Animal Tissue—Pagpili og presko, kusog nga nagtubo nga tisyu.Plant Tissue – Pilia ang presko, batan-ong tissue.

Tingali nakamatikod ka nga adunay mahinungdanong pulong niining pipila ka mga sentence: presko .
Alang sa mga sample sa ibabaw, ang labing maayo, epektibo sa gasto, ug lig-on nga kit sa merkado mao ang Foregene's kit, nga dali ug dali makuha ang ilang DNA ug RNA.

Dugo DNA Mini Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

Animal Total RNA Isolation Kit

Tanum Total RNA Isolation Kit

Tanum Total RNA Isolation Kit Plus

Plant DNA Isolation Kit

Pagtipig sa mga eksperimento nga materyales
Sa kinatibuk-an nga pagsulti, dili namo girekomenda ang pagtipig sa mga sample, kung gitugotan sa mga kondisyon.Bisan pa, adunay daghang mga higala nga dili makahimo og mga eksperimento diha-diha dayon pagkahuman sa sampling, ug ang uban kinahanglan pa nga magdala og mga tangke nga likido nga nitroheno ngadto sa uma para sa sampling.

Alang niining matang sa kugihan nga higala, makaingon lang ko nga dili nimo masabtan ang mga reagent consumables.Karon daghang mga reagent consumable nga mga kompanya ang naghimo og mga reagents nga makatipig sa mga sample sa RNA sa temperatura sa kwarto, ug mahimo nimong pilion nga gamiton kini.Ang naandan nga paagi sa pagtipig mao ang pagtipig sa nitroheno nga likido, gamit ang usa ka gamay nga tanke nga likido nga nitroheno nga dali madala.Human madala ang sample balik sa laboratoryo, ibutang kini sa -80°C refrigerator.

Alang sa mga eksperimento nga naglambigit sa RNA, ang unom ka pulong nga prinsipyo kinahanglan sundon:ubos nga temperatura, walay enzyme,ugpaspas .

Ang konsepto sa ubos nga temperatura sayon ​​sabton;walay enzymes, RNase mao ang bisan asa sa kalibutan nga atong gipuy-an (kon dili ikaw unta gipatay sa HIV), mao nga sa unsa nga paagi sa paglikay sa RNase sa diha nga ang pagbuhat sa mga eksperimento mao ang usa ka importante kaayo nga konsepto;paspas,Walay Kung Fu sa kalibutan nga dili mabuak, ang tulin lang dili mabuak.

Busa, sa usa ka diwa, ang mas mubo nga panahon sa pagkuha, mas maayo ang kit.Ngano manForegeneGipasiugda sa kit ang katulin, tungod kay nahibal-an nila kini pag-ayo.

PS: Ang ubang mga babaye nag-eksperimento pag-ayo, apan dili sila sama ka maayo sa slam dunk human sa pipila ka tuig nga pagtrabaho.Ilang gibati nga ang Diyos dili makiangayon, nagreklamo bahin sa uban, ug nangitag kinabuhi.Sa pagkatinuod, wala siya makasabot niini.Wala niya maprotektahan og maayo ang RNA, ug ang slam dunk player abtik.Sa paghimo niya sa eksperimento, naghunahuna siya nga mahuman niya ang slam dunk sa tulo ka beses, lima ka beses ug duha ka dibisyon, apan nahimo niya nga maayo ang eksperimento.

Nota: Mas hinay, mas daghang kahigayonan sa pagsulong sa RNase.Unsaon pagbansay sa imong kaugalingon nga mahimong paspas?Walay paagi, pagpraktis lang og dugang.

Alang sa lain-laing mga eksperimento ug lain-laing mga sampol, gikinahanglan gihapon nga basahon ang dugang nga literatura ug pilion ang angay nga paagi sa pagproseso.Alang sa sample nga pagkolekta ug proseso sa pagtipig, ang MIQE nagkinahanglan nga kini kinahanglan nga tin-aw nga gisulat sa papel, aron ang mga tigrepaso makasusi sa pagkakasaligan sa papel, ug kini usab sayon ​​​​alang sa nakugang nga mga batan-on sa pagsubli sa imong eksperimento.

Bisan tuod lisud ang biolohikal nga mga eksperimento, kini high-end.Kung dili ka mag-amping, mahimo nimong balihon ang kalibutan.Pananglitan, ang paghimo sa SARS nga usa ka biochemical nga krisis, o paghimo sa hybrid nga bugas aron maluwas ang 1.3 bilyon nga mga tawo.Ang hulagway sa ubos kay kemikal nga eksperimento, angay nimong sabton kung unsa ka mapahitas-on sa imong panukiduki pinaagi lang sa pagtan-aw sa iyang hitsura nga morag dick.Kalimti na, ayaw siyag itom.

MIQE (3) – pagkuha sa nucleic acid.
Ang pagkuha sa nucleic acid usa ka dako nga panghitabo, ug ang tanan nga mga eksperimento sa biology sa molekula nagsugod sa pagkuha sa nucleic acid.Una sa tanan, kopyahon nato ang sulod sa MIQE sa nucleic acid extraction.

Sa pagtan-aw niini nga porma, dili ka makapabilin sa ibabaw.Ang porma kay dogma.Aron mahimong usa ka top nga estudyante, kinahanglan ka mangutana kung ngano.Ang hinungdanon nga sulud niini nga lamesa mao ang: Pagpadayonang kaputli, integridad, pagkamakanunayon, ug gidaghanon sa pagkuha sa RNA .

Ang unang bahin saproseso o instrumento mao ang lakang sa pagkuha sa nucleic acid.Kung mogamit ka og awtomatik nga nucleic acid extractor sa pagkuha (advanced, palihog kontaka ako alang sa pagpalit), kinahanglan nimo nga ipakita ang modelo nga ngalan sa instrumento.

Ang ngalan sa kit ug

unsa nga kit ang gigamit alang sa mga detalye sa pagbag-o, unsa nga mga espesyal nga reagents ang gidugang o unsa nga mga espesyal nga operasyon ang gihimo kinahanglan nga klaro nga ipasabut aron ang uban dali nga makabalik sa imong eksperimento.

Ang ubang mga tawo nagdugang pipila ka mga espesyal nga reagents sa pagkuha sa mga espesyal nga sample, naghunahuna nga kini ang ilang sekreto nga hinagiban ug dili isulti sa uban.Samtang gitago kini, nawad-an usab sila sa higayon nga mapasinaw ang imong artikulo.Ayaw pagmaalamon, kinahanglan nga mas matinud-anon ka kay sa nasud nga tigulang nga Zhang sa siyentipikong panukiduki, kung gusto nimo nga maalamon, ang artikulo maghimo kanimo nga tanga.

kinahanglan hinumdoman ang numero sa produkto sa kitkung nag-order ka sa kit ug isulat ang artikulo.Sa kinatibuk-an adunay duha ka numero sa kit: Cat—catalog number (product number, article number), Lot—product lot number (Gigamit aron ipakita kung asa nga batch ang produkto gikan).

Dugang pa, ang numero sa CAS kanunay nga gigamit sa pag-order sa mga biochemical reagents, ug dungan nako nga itanyag kini.Ang numero sa CAS mao ang numero nga gihatag sa American Chemical Society sa matag bag-ong kemikal nga tambal.Kasagaran, tulo ka mga numero ang konektado sa usa ka dash.Numero sa CAS ni Rushui: 7732-18-5.Ang mga kemikal kasagaran adunay daghang mga alyas, apan ang numero sa CAS talagsaon.Kung mag-order og tambal, mahimo nimong susihon una ang numero sa CAS niini.

Mas duol sa panimalay, nganong kinahanglan natong ihulagway kini nga mga butang nga tin-aw?Sa tinuud, kini usab aron masusi ang kalidad sa pagkuha sa RNA.Ang paggamit sa mga instrumento ug mga kit maghimo sa RNA extraction nga mas makanunayon.Ang sukod sa pagkuha sa ordinaryong mga laboratoryo dili dako, ug kini makuha gamit ang mga kit.

Ang mga detalye sa pagtambal sa DNase o RNase
Ang importante nga isyu sa fluorescent quantitative PCR mao ang pagpugong sa kontaminasyon sa DNA, ug ayaw pag-eksperimento kung adunay kontaminasyon.Busa, kinahanglan nga ipahayag ang proseso nga imong gigamit sa pagproseso sa DNA, aron ipakita nga ang DNA sa proseso sa eksperimento hingpit ug hingpit nga gikuha.girepresentahan sa usa ka schematic diagram.

Schematic diagram sa RNA ug DNA
Sa kinatibuk-an, ang pamaagi sa pagtangtang sa DNA mao ang pagtratar sa RNA nga adunay DNase pagkahuman sa pagkuha.Bisan pa, kini medyo karaan nga mga pamaagi.Ang komersyal nga RNA extraction kits nakahimo sa pagtangtang sa DNA sa panahon sa proseso sa pagkuha nga wala magdugang DNase.Pananglitan, usa ka serye sa mga kit gikan sa Foregene.

Nota: Ang pagtangtang sa DNA atol sa RNA extraction kay delikado kaayo nga double-edged sword, nga magpalugway sa oras sa operasyon sa RNA extraction ug makadugang sa risgo sa RNA degradation.Sa panguna, kini usa ka trade-off tali sa ani ug kaputli sa RNA.

Dugang pa, ang gidaghanon sa DNase nga idugang sa silica-based adsorption column gamay ra kaayo, ug ang taas nga kalidad nga DNase kinahanglang gamiton aron makab-ot ang epekto.Ang wala ma-optimize nga DNase dili dali ug hingpit nga matunaw.Kini usa ka pagsulay sa teknikal nga lebel sa negosyante.Siyempre, adunay mas talagsaon nga mga negosyante nga nanghambog nga ang DNA mahimong makuha nga walay DNase.Mahimong ingnon nga bisan kinsa nga manghambog nga ang DNA mahimong hingpit nga matangtang kung wala ang DNase usa ka hooligan.Ang DNA usa ka medyo lig-on nga double-stranded nga istruktura, ug dili kini mapapas pinaagi lang sa pagsulti ug pagkatawa.

Pagsusi sa kontaminasyon
pamaagi sa pagtasa: electrophoresis detection, 1% agarose, 6V/cm, 15min, loading 1-3 ul

Nucleic acid quantitative analysis
kasagarang gisukod gamit ang UV spectrophotometer.Tugoti ako nga itanyag una ang kahulugan sa tulo nga mga kantidad sa OD260, OD280, ug OD230.
·OD260nm: Kini ang pagsuyup sa wavelength sa pinakataas nga pagsuyup nga peak sa nucleic acid, ug ang labing maayo nga gisukod nga kantidad gikan sa 0.1 ngadto sa 1.0.Kung dili, dilute o i-concentrate ang sample aron madala kini sa sulud.
·OD280nm: Kini ang pagsuyup sa wavelength sa pinakataas nga pagsuyup nga peak sa protina ug phenolic nga mga butang.
·OD230nm: Kini ang pagsuyup sa wavelength sa pinakataas nga pagsuyup nga peak sa carbohydrates.

Sunod, atong hisgutan ang bahin sa papel sa matag timailhan.Para sa A260, mahimo kining gamiton sa pagsukod sa abot sa nucleic acid.Kung OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Alang sa kaputli, kinahanglan natong tan-awon ang mga ratios nga kasagaran natong makita: OD260/280 ug OD260/230.
·Purong DNA: Ang OD260/280 halos katumbas sa 1.8.Kung kini labaw pa sa 1.9, kini nagpakita nga adunay polusyon sa RNA, ug kung kini ubos pa sa 1.6, kini nagpakita nga adunay polusyon sa protina ug phenol.
· Purong RNA: 1.7
·OD260/230: DNA man o RNA, ang reference value kay 2.5.Kung kini ubos sa 2.0, kini nagpakita nga adunay polusyon sa asukal, asin ug organikong butang.

Integridad sa RNA

Importante kaayo ang pagsukod sa integridad sa RNA.Kasagaran, kinahanglan nga maghimo usa ka eksperimento sa RNA denaturation gel aron masusi kung ang kahayag tali sa 28S ug 18S RNA usa ka duha ka pilo nga relasyon.Sa diha nga ang ikatulo nga banda 5S makita, kini nagpasabot nga ang RNA nagsugod sa pagkadaot, gawas sa invertebrates.

Mga datos alang sa pagsusi sa kalidad sa RNA: Dugang pa sa mga pagsulay sa ibabaw, adunay pipila usab nga mas abante nga mga pagsulay sa instrumento sa mga termino sa integridad sa RNA, sama sa RQI integrity test sa Experion automatic electrophoresis system, nga makamatikod kung ang RNA gipaubos nga dili makita.

Sa siyentipikong panukiduki, ang fluorescent quantitative PCR usa ka pagtandi tali sa target nga gene ug sa internal nga reference gene.Busa, sa proseso sa pagpreserbar sa sample sa RNA, pagkuha sa RNA, ug uban pa, ang panguna nga katuyoan mao ang pagsiguro sa integridad sa RNA.

Sa unsang paagi ang integridad sa RNA makaapekto sa balanse tali sa target nga gene ug sa internal nga reperensiya nga gene daling masabtan gikan sa hulagway sa ubos.Ang pagkadaot magdala ngadto sa pagkadili kompleto sa gene, kini man ang pagkadili kompleto sa internal nga reference gene o ang pagkadili kompleto sa target nga gene, kini adunay dakong epekto sa datos.

Ang schematic diagram sa target nga gene ug reference gene, kinahanglang dili tinuod

Pagsulay sa pagpugong (kon ang CT nga kantidad gipugngan ubos sa taas o ubos nga konsentrasyon o uban pang mga kondisyon)

Gikuha kini nga numero ingon usa ka pananglitan, ang mga kantidad sa Ct sa lima ka kurba mao ang mga musunud.Ang pag-apod-apod sa mga kantidad sa CT tali sa mga kurba dili patas, ug ang mga kantidad sa Ct nalangan ubos sa taas ug ubos nga konsentrasyon, nga mao ang kaso sa pagdili sa PCR.

Pangunang punto: Sa proseso sa pagkuha sa RNA, kinahanglan natong biyaan ang mga sayop nga pagtuo ug magtukod ug husto.

Ang sayop nga ideya mao ang: Ang pagkuha sa RNA nagpadayon lamang sa abot, naghunahuna nga ang mas dako nga kantidad sa RNA nga makuha, mas maayo.Sa tinuud, kung maghimo kita og quantification, kung ang gidaghanon sa mga gene dili kaayo dako, wala na kita magkinahanglan og daghang RNA.Ang gidaghanon sa RNA nga imong gikuha labaw pa sa igo.

Ang husto nga konsepto mao ang:Ang pagkuha sa RNA kinahanglan nga magpadayon sa kaputli, integridad ug pagkamakanunayon.Ang kaputli makaseguro nga ang sunod nga reverse transcription dili mapugngan ug ang datos dili maapektuhan sa DNA.Ang integridad nagsiguro sa balanse sa mga target nga han-ay ug internal nga mga pakisayran.Ang pagkamakanunayon nagsiguro sa lig-on nga pagkarga sa sample.

MIQE (4) – reverse transcription
Sayop nga pagsabot: ang pagpangita sa mas taas nga sample volume.
Husto nga konsepto: Ipadayon ang pagkamakanunayon (kalig-on), bisan unsa pa ang gidaghanon sa RNA nga gikarga, ang kahusayan sa reverse transcription nagpabilin nga makanunayon, pagsiguro nga ang mga kalainan sa cDNA tinuod nga nagpakita sa mga kalainan sa mRNA.
Gipatin-aw namo kini nga proseso gamit ang schematic diagram:

Schematic diagram sa reverse transcription efficiency, dili tinuod
Una sa tanan, kinahanglan natong masabtan ang kalainan tali sa reverse transcription process ug sa PCR process.Ang PCR nag-agi sa daghang mga proseso sa pagpainit ug pag-annealing, ug ang target nga tipik motubo nga kusog;samtang ang reverse transcription wala niini nga proseso, atong mahanduraw nga ang reverse transcription sa tinuod usa-sa-usa Sa panahon sa proseso sa pagkopya, sama sa daghang piraso sa RNA

tungod kay adunay makakuha og ingon ka daghan nga mga piraso sa cDNA nga Impormasyon, kini kinahanglan nga masabtan sa pagkakaron, tungod kay ang mga tipik nga dagko ug gagmay gi-reverse-transcribe, ug imposible nga mag-focus sa usa ka tipik.Ug tungod kay ang gidaghanon sa RNA gamay ra, ang kantidad sa cDNA nga nakuha gamay ra usab, dili sama sa PCR, nga adunay usa ka amplification nga epekto, mao nga imposible nga mahibal-an.

Mga resulta sa electrophoresis sa cDNA
Ikaduha, labing maayo, ang reverse transcription gihimo nga usa-sa-usa, apan walay reverse transcriptase gikan sa bisan unsang kompanya ang makahimo niini nga epekto.Sa panguna, ang kaepektibo sa kadaghanan nga mga reverse transcriptases naglatagaw tali sa 30-50%.Kung mao kini ang kaso, mas gusto namon nga adunay usa ka medyo lig-on nga reverse transcription efficiency, nga mao ang gusto namon nga makita sa numero: 3 RNAs makakuha 2 cDNAs, 6 RNAs makakuha 4 cDNAs, mao nga bisan unsa ka daghan sa sample ang loaded , ang reverse transcription efficiency mao ang medyo lig-on.Dili namo gusto nga makita ang sitwasyon diin ang reverse transcription efficiency dili lig-on ug ang taas nga konsentrasyon gipugngan.

Busa, unsaon pag-verify kung lig-on ba ang kaepektibo sa reverse transcription?Ang pamaagi mao ang kaayo yano, nga kamo kinahanglan lamang sa pagbuhat sa usa ka pagtandi pagsulay: ang usa mao ang pag-reverse transcribe ngadto sa cDNA human sa pagdoble sa pagtunaw sa RNA, ug ang usa mao ang sa paghimo sa pagdoble sa pagtunaw human sa reverse transcribe ngadto sa cDNA, ug unya sa pagbuhat sa qPCR sa pagtan-aw sa nakuha nga bakilid mao ba kini makanunayon.Ingon usa ka top nga estudyante, kinahanglan nimo nga masabtan kini sa mga segundo.Ingon sa gipakita sa ubos:

Ang pagtunaw sa RNA ug cDNA aron masulayan kung ang kaepektibo sa reverse transcription lig-on
Reverse transcriptase ug kit
Giunsa ang perpekto nga fluorescent quantitative PCR adunay maayo kaayo nga reverse transcriptase ug kit.Ang reverse transcriptase halos gibahin sa duha ka matang sumala sa tinubdan, AMV oM-MLV, ug ang ilang pasundayag parehas sa gipakita sa lamesa.

RNase H nga kalihokan
Ang RNase H kay Ribonuclease H, ang Chinese nga ngalan kay ribonuclease H, nga usa ka endoribonuclease nga espesipikong maka-hydrolyze sa RNA sa DNA-RNA hybrid chain.Ang RNase H dili maka-hydrolyze sa phosphodiester bonds sa single-stranded o double-stranded nga DNA o RNA, sa ato pa, dili kini makahilis sa single-stranded o double-stranded nga DNA o RNA.Kasagarang gigamit sa synthesis sa ikaduhang strand sa cDNA.

Kini usa ka talagsaon nga butang.Kami nag-ingon nga ang reverse transcriptase adunay RNase H nga kalihokan, dili nga ang reverse transcriptase naglangkob sa RNase H, ug kini mahimong dili posible nga ibulag ang RNase H gikan sa reverse transcriptase, tingali tungod sa conformation sa pipila ka mga grupo sa reverse transcriptase Kini nga kalihokan gipahinabo sa reverse transcriptase.

Busa, bisan unsa pa ang mas taas nga reverse transcription efficiency sa AMV, ang RNase H nga kalihokan niini nagpamenos sa abot sa cDNA.Siyempre, ang mga tiggama sa reagent kanunay nga nag-optimize sa ilang mga produkto aron mawagtang ang kalihokan sa RNase H sa reverse transcriptase kutob sa mahimo aron madugangan ang abot sa cDNA.
Pag-ani nga temperatura

Ikaduha nga istruktura sa RNA sa lainlaing mga temperatura
Tan-awa ang numero sa ibabaw para sa sekondaryang istruktura sa RNA sa lain-laing mga temperatura, ug gamita ang mFold online nga himan aron mahibal-an ang ikaduhang istruktura sa target nga tipik ubos sa piho nga temperatura ug mga kondisyon sa konsentrasyon sa asin.Sa 55 ° C, ang ikaduha nga istruktura sa RNA komplikado pa kaayo, ang reverse transcriptase dili molihok, ug ang ikaduha nga istruktura dili hingpit nga masulbad hangtod sa 65 ° C, samtang ang labing kaayo nga temperatura sa AMV ug M-MLV labi ka ubos kaysa niini nga temperatura.
Unsay buhaton?Ang sekondaryang istruktura mao ang komplementaryong pagpares sa template mismo, nga mosangpot sa kusog nga kompetisyon tali sa primer ug reverse transcriptase ug sa template, nga miresulta sa sunod-sunod nga mga problema sama sa ubos nga E ug dili maayo nga repeatability.

Unsay buhaton?Dugangi lamang ang temperatura sa annealing kutob sa mahimo.

Daghang mga tiggama sa reagent ang nagpauswag sa ilang reverse transcriptase pinaagi sa genetic engineering.Ang uban nagdugang sa temperatura sa reaksyon, sama sa Jifan ug Aidelai, ug ang uban nagtangtang sa aktibo nga grupo sa RNase H enzyme aron mapauswag ang kalambigitan tali sa enzyme ug sa template sa RNA.Ang taas nga affinity mahimo nga makigkompetensya sa pagpislit sa sekondaryang istruktura ug pagbasa nga hapsay, ug labi usab nga mapauswag ang pagkaayo sa reverse transcription.
Pangunang punto: Ang reverse transcription mao ang mas importante sa pagpadayon sa pagkamakanunayon sa reverse transcription efficiency (enzymes kinahanglan nga dili lamang episyente apan usab lig-on), kay sa gidaghanon sa sample loaded, kon kini dili usa ka partikular nga dako nga-scale fluorescent quantitative PCR, kini dili mahimo sa tanan.Daghang mga cDNA.
Ang lainlaing mga tiggama naghimo usab og pipila ka mga paningkamot sa pagpangita sa pagkamakanunayon.Pananglitan, kadaghanan sa mga kompanya karon nagputos sa reverse transcription isip usa ka standard kit nga ibaligya, nga usa ka maayong pagpili.
Pananglitan, ang Foregene's RT Easy Series kits:

RT Easy I(Master premix para sa first strand cDNA synthesis kit)

MIQE (5) – target nga impormasyon sa gene

Ang numero sa ibabaw nagpatin-aw
1. Kung epektibo ba kini nga gene alang sa gibalikbalik nga mga eksperimento sa kasagaran mapamatud-an pinaagi sa gibalikbalik nga mga eksperimento.
2. Gene ID, nahibal-an nimo.
3. Ang gitas-on sa gene, ang kinatibuk-ang gitas-on sa target nga gene siguradong walay problema.Kung nagdesinyo sa mga primer, siguroha nga ang gitas-on sa amplicon anaa sa taliwala sa 80-200bp aron masiguro ang usa ka mas maayo nga amplification efficiency.
4. Sequence Blast nga pagtandi nga impormasyon, ang target nga gene kinahanglan nga itandi sa genebank aron mapugngan ang dili piho nga pagpadako.
5. Ang presensya sa mga pseudogenes.Ang usa ka pseudogene usa ka pagkasunod-sunod sa DNA nga susama sa usa ka normal nga gene apan nawala ang normal nga function niini.Kasagaran kini anaa sa multi-gene nga pamilya sa mga eukaryote.Kasagaran kini girepresentahan sa ψ.Kini usa ka non-functional genomic DNA nga kopya sa genome nga susama kaayo sa coding gene sequence., kasagaran wala gi-transcribe, ug walay klaro nga physiological nga kahulogan.
6. Posisyon sa mga primer nga may kalabotan sa mga exon ug intron.Sa unang mga tuig, sa dihang nasulbad namo ang problema sa kontaminasyon sa DNA, kanunay namong gihatagan ug pagtagad ang mga posisyon sa mga primer, exon, ug intron, ug kasagarang gikonsiderar ang pagdesinyo sa mga primer sa tibuok intron aron malikayan ang pagpadako sa DNA.Palihug tan-awa ang hulagway sa ubos: itom nagrepresentar sa mga intron, lain-laing mga blues nagrepresentar sa mga exon, pink nagrepresentar sa komon nga primers, ug mahayag nga pula nagrepresentar sa intron-spanning primers.

Schematic, dili tinuod
Daw unsa ka hingpit nga plano kini, apan sa pagkatinuod, sa kadaghanang mga kaso, ang trans-intron primers dili sama ka mahika sama sa gihunahuna, ug kini usab magpahinabog dili piho nga pagpadako.Busa ang pinakamaayong paagi sa pagpugong sa kontaminasyon sa DNA mao ang pagtangtang sa DNA sa hingpit.
7. Pagtag-an sa conformation.Gamit kini nga pananglitan pag-usab, gamita ang mFold online nga himan aron mahibal-an ang ikaduha nga istruktura sa target nga tipik sa usa ka piho nga temperatura ug konsentrasyon sa asin.

Ikaduha nga istruktura sa RNA sa lainlaing mga temperatura
Ang sekondaryang istruktura mao ang komplementaryong pagpares sa template mismo, nga mosangpot sa lig-on nga kompetisyon tali sa primer ug template nga pagpares, ug ang kahigayonan sa primer binding mas gamay, nga moresulta sa sunod-sunod nga mga problema sama sa ubos nga E ug dili maayo nga repeatability.Pinaagi sa pagtagna sa software, kung wala’y problema sa ikaduha nga istruktura, maayo kana.Kung naa, ang among follow-up nga artikulo espesipikong maghisgot kung unsaon pagsulbad kini nga problema.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides

Para sa fluorescent quantitative PCR, ang unang butang nga imong pakigbisogan kada adlaw mao ang RNA extraction, ug ang ikaduhang butang mahimong primerong disenyo.
Una sa tanan, gisusi pa namo ang mga lagda bahin sa primerong disenyo sumala sa checklist sa MIQE.Yano ra kaayo nga ang mga scumbags makatawa, ug mahimo naton kini tapuson sa usa ka sentence: hibal-i ang han-ay ug posisyon sa primer probe ug ang pamaagi sa pagbag-o.Alang sa primer nga pamaagi sa pagputli, ang primer synthesis barato kaayo sa pagkakaron, ang qPCR takus sa PAGE ug labaw sa mga pamaagi sa pagputli, ug ang impormasyon sa instrumento sa synthesis dili importante.Daghang mga tawo ang naghimo sa mga primer sa mga dekada ug wala nahibal-an nga ang synthesizer mao ang ABI3900.
Mahitungod sa mga prinsipyo sa primer design, dili nimo kinahanglan nga sag-ulohon kini pinaagi sa pag-rotate, tungod kay ang kadaghanan sa primer design software o online nga mga himan makaatiman niini nga mga problema (girekomendar online nga himan primer3.ut.ee/), ug 99.999% sa primer nga disenyo wala gihimo sa mano-mano Tan-awa, ang tagsulat usahay nagdesinyo og gatusan ka mga primer sa usa ka adlaw, kon basahon nimo ang usa-usa, kini mahimong cross-eyed.
Susiha lang ang mosunod nga mga punto human ang mga primer gidisenyo:
1. Design primers duol sa 3′ end: Sa kaso sa paggamit sa oligo dT primers para sa cDNA first-strand synthesis, nga gikonsiderar ang reverse transcription efficiency ug RNA integrity, ang gidisenyo nga primers kinahanglan nga gidisenyo duol sa 3′ end aron mapalambo ang amplification efficiency .Gamit ug hulagway para ipatin-aw sama sa mosunod (walay paagi nga masabtan kini):

Ngano nga ang mga primer kinahanglan nga gidisenyo duol sa 3′ nga katapusan, kini kinahanglan nga dili tinuod
2. TM value: Ang Tm value anaa sa 55-65°C (tungod kay ang exonuclease activity mao ang pinakataas sa 60°C), ug ang GC content anaa sa 40%-60%.
3. BLAST: Aron malikayan ang dili piho nga pagpadako sa genome, ang Blast kinahanglan gamiton alang sa dugang nga pag-verify.

MIQE(7)—proseso sa qPCR

1. qPCR kit
Sumala sa mga kinahanglanon sa MIQE, kinahanglan naton nga tin-aw nga ihulagway ang kompleto nga mga kondisyon sa reaksyon sa artikulo, lakip ang pag-configure sa sistema sa reaksyon sa PCR, kung unsang kit ang gigamit, kinsa ang tiggama, kung unsa kadako ang sistema sa reaksyon, kung gigamit ang pamaagi sa tina o pamaagi sa pagsusi, mga setting sa programa sa PCR.Ang mga beteranong drayber siguradong makit-an nga basta pilion ang kit, ang kasayuran sa ibabaw matino.
Sa pagkakaron, ang paghimo ug paghimo sa fluorescent quantitative PCR kits kay hingkod na kaayo nga teknolohiya.Hangtud nga dili ka magpili labi ka daotan nga mga tiggama, ang posibilidad sa mga problema dili taas, apan gusto namon nga ipaambit kanimo ang pipila ka mga punto:
Mainit nga pagsugod sa Taq enzyme:Ang labing importante nga bahin sa PCR mao ang init-pagsugod nga Taq enzyme.Ang mga hot-start enzymes sa merkado kasagarang gibahin sa duha ka matang, ang usa kay chemically modified hot-start enzyme (mahunahuna nimo kini isip paraffin embedding), ug ang usa mao ang Hot-start enzyme para sa antibody modification (antigen-antibody binding).Ang pagbag-o sa kemikal usa ka sayo nga paagi sa init nga pagsugod sa mga enzyme.Kung maabot ang usa ka temperatura, ang enzyme mopagawas sa kalihokan niini.Ang antibody-modified hot-start enzyme naggamit ug biolohikal nga mga pamaagi aron babagan ang kalihokan sa enzyme.Kung maabot ang usa ka piho nga temperatura, ang antibody ma-denatured ug dili aktibo ingon usa ka protina, ug ang kalihokan sa enzyme madala sa pagdula.

Apang, ano ang kapuslanan sini?Mao kini ang kaso, ang kalihokan sa pagpagawas sa mga enzyme nga gibag-o sa antibody mas paspas kaysa sa mga enzyme nga gibag-o sa kemikal, mao nga sa mga termino sa pagkasensitibo, ang mga enzyme nga gibag-o sa antibody adunay gamay nga bentaha, mao nga sa panguna wala’y gibag-o nga kemikal nga mga enzyme sa mga kit sa merkado.Kung naa, nan ang teknolohiya sa tiggama nagpabilin gihapon sa panahon sa milenyo.
Konsentrasyon sa Magnesium Ion:Ang konsentrasyon sa magnesium ion hinungdanon kaayo sa reaksyon sa PCR.Ang angay nga konsentrasyon sa magnesium ion makapauswag sa pagpagawas sa kalihokan sa Taq enzyme.Kung ang konsentrasyon ubos kaayo, ang kalihokan sa enzyme makunhuran pag-ayo;kung ang konsentrasyon taas kaayo, ang enzyme-catalyzed non-specific amplification mapalambo.Ang konsentrasyon sa mga magnesium ion makaapekto usab sa pag-annealing sa mga primer, ang temperatura sa pagtunaw sa template ug mga produkto sa PCR, sa ingon makaapekto sa abot sa mga gipadako nga mga tipik.Ang konsentrasyon sa magnesium ion kasagarang kontrolado sa 25mM.Siyempre, alang sa usa ka maayo nga kit, ang konsentrasyon sa magnesium ion kinahanglan nga maayo nga kontrolado.Ang ubang mga negosyante makadugang ug magnesium ion chelating agent sa reagent, nga makab-ot ang epekto sa awtomatik nga pag-adjust sa konsentrasyon sa magnesium ion.
Fluorescent nga tina nga konsentrasyon:Ang fluorescent nga tina, nga mao ang SYBR Green nga kasagaran natong gigamit, nag-una nga nagmugna og fluorescence pinaagi sa pagbugkos sa menor de edad nga lihok sa double-stranded nga DNA, tungod kay ang pagbugkos sa tina ngadto sa double-stranded nga DNA dili espesipiko, sa ato pa, basta ang double-stranded nga DNA gikombinar niini, ang fluorescence mahimong mahitabo sa usa ka primera-template nga sistema.
PS: Tungod sa sensitibo sa kahayag niini, ang mga produkto sa merkado kasagarang giputos sa brown opaque centrifuge tubes (sama sa gipakita sa hulagway sa ubos).Apan, makasugat kini og problema.Lisod tan-awon kung gisuyop ba ang likido kung magsampol.Niining bahina, ang Qingke sa pagkatinuod mao ang labing user-friendly (sama sa gipakita sa hulagway sa ubos), ug ang transparent nga tubo giputos sa usa ka opaque tin bag.Dayon ibutang kini sa usa ka bag nga lata, nga gikonsiderar ang kasayon ​​​​sa paglikay sa kahayag ug sampling.Kinahanglan nimo nga pilion ang husto nga numero sa produkto.Ang TSE204 kay super cost-effective nga paglungtad, nga gusto nako magtanom ug balili.

Ang konsentrasyon sa fluorescent nga tina hinungdanon usab.Kon ang konsentrasyon ubos kaayo, ang amplification curve dili mosaka sa ulahing yugto ug dili hingpit;kung ang konsentrasyon taas kaayo, kini hinungdan sa pagkabalda sa kasaba.Tungod kay ang fluorescent quantitative PCR nag-una nagdepende sa CT nga kantidad, kung ang konsentrasyon sa fluorescent dye dili ma-adjust sa husto, ang ubos nga punto mas maayo kaysa sa taas nga punto.Siyempre, ang angay nga konsentrasyon sa tina mao ang labing kaayo.

ROX: Ang mga tina sa ROX gigamit aron matul-id ang mga sayup nga signal sa fluorescence nga maayo.Ang ubang mga tiggama sa instrumento nanginahanglan pag-calibrate, samtang ang uban wala.Pananglitan, ang paggamit sa Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR amplification instrument kasagarang nanginahanglan ug calibration, lakip ang 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ug uban pa. Ang kinatibuk-ang instruksyon sa kit maghulagway niini.
Ang Foregene's qPCR Mix usab adunay ROX nga tina, nga sayon ​​​​gamiton sa lainlaing mga modelo.

Tinuod nga Oras nga PCR Kit-Taqman

Huyang nga pagtambal sa hydrogen bond: Ang pagtambal sa huyang nga hydrogen bond kay medyo teknikal nga butang.Walay nakabasa sa mga manwal sa daghang mga kit, apan walay usa kanila nga naghisgot niini nga hilisgutan.Sa pagkatinuod, kini importante kaayo.Ang kombinasyon sa mga base nag-una nagdepende sa kusog sa hydrogen bonds.Ang lig-on nga hydrogen bond mao ang normal nga amplification, ug ang huyang nga hydrogen bonds mosangpot sa dili piho nga amplification.Kung ang huyang nga hydrogen bonds dili mawagtang nga maayo, ang dili piho nga pagpadako dili malikayan.Sulod sa sakup sa tagsulat, pipila ra nga mga kompanya ang nakamatikod niini nga problema.Kung gipalit nimo ang kit, mahimo nimong i-refer kung gikonsiderar nimo ang solusyon bahin niini alang sa kit nga gusto nimo pilion.

Gidaghanon sa reaksyon: Ang 20-50ul nga sistema mas sagad nga gigamit, ug ang gagmay nga mga volume lagmit nga hinungdan sa mga sayup.Sa kinatibuk-an, ang mga panudlo sa kit magrekomenda sa paggamit sa mga volume sa reaksyon sa PCR.Ayaw pagmaalamon ug gamita ang gagmay nga mga volume aron makadaginot sa gasto.ang tumong sa.Ang gidaghanon nga girekomenda sa mga magpapatigayon aktuwal nga nasulayan, ug tingali dili nila masulbad ang problema sa mga sayup nga gipahinabo sa gagmay nga mga volume.
2. Ang tiggama ug numero sa artikulo sa tube plate
Nahibal-an sa tanan ang prinsipyo sa fluorescent quantitative PCR.Ang pagkolekta sa fluorescence sa panguna gihimo pinaagi sa mga takup sa tubo sa PCR.Sa pagpili sa PCR consumables, pagtagad sa duha ka punto: maayo nga kahayag transmission ug angay alang sa instrumento.Sa kinatibuk-an, ang mga tabla ug mga tubo sa mainstream nga mga tatak maayo, apan kinahanglan ka nga mopili pag-ayo sa mga termino sa pagpahiangay, kung dili dili nimo magamit ang instrumento.

4. Top level nga kahibalo

MIQE (8)—pagbalido sa qPCR
Kini ang nag-unang prayoridad sa qPCR!Daghang mga bayani ang nahulog sa balas dinhi.Siyempre, posible usab nga swerte ka ug ang mga gene nga imong gitun-an yano ra, mao nga naglutaw ka sa ice cave subay sa hangin.Ang impormasyon sa pag-verify sa qPCR gituyo aron sulayan ang pagkakasaligan sa datos.Gilista namo ang gikinahanglang impormasyon sa pag-verify sama sa mosunod:

1.Espesipiko nga pagsulay
Ang espesipiko sa target gene amplification gisulayan pinaagi sa pagsusi kung ang electrophoresis nga hulagway usa ka banda;sequencing verification;natunaw nga kurba aron makita kung ang peak nga mapa usa ra;pag-verify sa pagtunaw sa enzyme ug uban pang mga pamaagi.
Dinhi, nagpunting kami sa tpagtuki sa non-specific amplification gamit ang pamaagi sa pagtunaw sa mga kurba.Sa kinatibuk-an nga pagsulti, kung magdesinyo kami og mga primer, ang gidak-on sa tipik sa produkto gikinahanglan nga anaa sa hanay nga 80-200bp, nga naghimo sa temperatura sa pagtunaw sa produkto sa PCR nga 80-85 °C range.Busa, kung adunay lainlain nga mga taluktok, kinahanglan adunay uban pang dili piho nga mga produkto sa pagpadako;kung ang peak makita ubos sa 80 ° C, kini sa kasagaran giisip nga usa ka primer dimer;kung ang peak makita sa ibabaw sa 85 ° C, kini sa kasagaran giisip nga kontaminasyon sa DNA o labaw pa nga Nonspecific amplification sa dagkong mga tipik.
Mubo nga sulat: Usahay adunay usa lamang ka peak sa 80°C.Niini nga panahon, kini nga konsepto kinahanglan nga sundon.Lagmit nga ang mga resulta sa pagpadako mao ang tanan nga mga primer dimer.

Normal nga kurba sa pagkatunaw (usa ka taluktok nga walay non-specific amplification)

Problematiko nga kurba sa pagkatunaw (dili piho nga pagpadako sa dili tinuod nga mga taluktok)
【Pagtuki sa kaso】

Adunay usa ka nag-unang peak, apan ang primer dimer seryoso
Ang single-peak melting curve sa hulagway sa ubos daling makalingla sa imong mga mata, naghunahuna nga kini usa ka hingpit nga eksperimento, apan ang resulta hingpit nga sayup.Niini nga panahon, kinahanglan natong tan-awon ang temperatura sa pagtunaw.Ang kinapungkayan nga temperatura ubos sa 80°C, nga hingpit nga primer-dimer.

Walay target nga tipik, ang tanan nga primer dimer
Dinhi, ang akong igsoon dili makapugong.Ang hulagway sa ubos usa ka litrato nga gikuha gamit ang usa ka mobile phone nga gipadala kanako sa usa ka scumbag.Ang mga reagents nga iyang gigamit kay kasagarang gigamit nga mga tatak sa industriya.Nagbag-o siya gikan sa usa ka T-prefix nga brand ngadto sa laing T-prefix nga brand.Abi nakog nakatag-an na ka.Ang scumbag mihilak kanako: “Ang reagent nga gigamit sa unang hulagway maayo kaayo, ug ang peak single.Sa ulahi, human sa paggamit sa reagent nga imong girekomendar, kini mahimong sama sa ikaduha nga hulagway, uban sa nagkasagol nga mga taluktok.Gibuhat ko nimo nga miserable.“
Ibulag ang duha ka mga graph.Sa una nga pagtan-aw, ang usa adunay usa ka peak, ug ang lain adunay doble nga peak.Ang walay pulos, usa ka peak siyempre maayo.Tinuod na?
Mas grabe pa sa Dou E, kung ibutang nako ang duha ka mga hulagway sa hulagway sa ubos, masabtan dayon nimo.Sa pagkatinuod, dali ra kitang maparalisar niining matang sa hulagway.Human sa maampingong pagtuki, among nakita nga: ang kinapungkayan sa unang numero anaa sa 75°C, nga bug-os nga primer dimer;ang kinapungkayan sa ikaduhang numero makita sa 75 ° C ug 82 ° C, labing menos adunay Ang produkto makita.

Mga hulagway sa feedback gikan sa mga estudyante
Busa ang sukaranang problema dili ang problema sa mga reagents, kondili ang problema sa primerong disenyo.Sa samang higayon, kini usab nagpamatuod nga ang pipila ka dagkong mga tatak dili kalidad sa puthaw, ug kini usab nagpamatuod sa gisulti sa akong igsoon kaniadto: Dili ang reagent brand nga nagsuporta sa imong artikulo.Kini ang imong artikulo nga nagpasiugda sa tatak sa mga reagents.Hunahunaa lang, kung ang scumbag dili mag-usab sa mga reagents, ang sayup nga datos ipadala sa journal, ug kung unsa ang mahitabo usa ka trahedya.
2. Ct nga bili sa blangko nga kontrol
Ayaw ipasabut, kung ang blangko nga kontrol adunay Ct nga kantidad, dili ba kini polusyon?Bisan pa, kinahanglan nimo nga masabtan kung unsang blangko nga kontrol ang adunay kantidad nga Ct.Kon NTC, nagpasabot nga dunay langyaw nga DNA sama sa reagent contamination.Kung kini NRT, kini nagpasabut nga ang nakuha nga RNA adunay kontaminasyon sa DNA.
3. Standard nga kurba
Lakip ang slope ug kalkulasyon nga pormula, ang kahusayan sa PCR mahimong kalkulado pinaagi sa pormula.Ang usa ka hingpit nga eksperimento nagkinahanglan sa slope sa standard curve sa pagduol sa 3.32, ug R² sa pagduol sa 0.9999.
4. Linear dynamic range
Ang dinamikong range sa reaksyon linear.Sumala sa template nga gigamit sa pagmugna sa standard curve, ang dinamikong range kinahanglan nga maglakip sa labing menos 5 nga mga gradient sa konsentrasyon, ug pagtagad sa pagbag-o sa mga kantidad sa Ct sa taas nga mga gradient sa konsentrasyon ug ubos nga mga gradient sa konsentrasyon.
5. Pagkatukma sa detection
Ang mga pagbag-o sa mga resulta sa qPCR, sa ato pa, dili maayo nga pagbalik-balik, nga mao, dili maayo nga katukma, tungod sa daghang mga hinungdan, lakip ang temperatura, konsentrasyon, ug operasyon.Ang katukma sa qPCR sa kasagaran dili kaayo makontrol samtang ang gidaghanon sa kopya mikunhod.Labing maayo sa sulod sa eksperimento nga kalainan, kini nga teknikal nga kalainan kinahanglan nga lahi sa biolohikal nga pagbag-o, ug ang biolohikal nga mga replika mahimo nga direkta nga matubag ang mga kalainan sa istatistika sa mga resulta sa qPCR tali sa mga grupo o pagtambal.Sa partikular alang sa diagnostic assays, ang labing maayo nga inter-assay precision (repeatability) sa tibuok nga mga site ug operators kinahanglang i-report.
6. Detection efficiency ug LOD (sa multiplex qPCR)
Ang LOD mao ang kinaubsan nga konsentrasyon sa 95% sa mga positibo nga sample nga nakita.Sa laing pagkasulti, ang konsentrasyon sa LOD nga anaa sulod sa usa ka set sa target nga gene nga mga replikasyon kinahanglang dili molapas sa 5% sa mga napakyas nga reaksyon.Sa paghimo sa multiplex qPCR analysis, ilabi na alang sa dungan nga detection sa point mutations o polymorphisms, multiplex qPCR kinahanglan nga mohatag og ebidensya nga ang katukma sa daghang mga target fragment dili makompromiso sa samang tubo, multiple detection ug single tube detection Efficiency ug LOD kinahanglan nga managsama.Ilabi na kung ang taas nga konsentrasyon nga target nga mga gene ug ubos nga konsentrasyon nga target nga mga gene dungan nga gipadako, kini nga problema kinahanglan nga hatagan pagtagad.
Mga problema ug solusyonSa kinatibuk-an, ang mga problema nga kasagarang masugatan sa qPCR debugging nagpunting sa mosunod nga mga aspeto:
· dili piho nga pagpadako
· Lisud nga pagpili sa primerong konsentrasyon ug kasamok sa primer-dimer
· Ang annealing temperatura dili tukma
· Ang ikaduha nga istruktura makaapekto sa pagkaayo sa pagpadako
nonspecific amplification
dili piho nga pagpadakomahitabo , kasagarang gikonsiderar kung ang disenyo sa primer dili angay, apan kung dili ka magdali sa pag-usab sa mga primer, mahimo nimong sulayan una ang mosunod nga mga pamaagi (ang prinsipyo gilakip usab):
· Dugangi ang temperatura sa annealing – sulayi paghimo ang huyang nga hydrogen bonds nga dili makapadayon;
·Pamubo ang panahon sa annealing ug elongation – pagpakunhod sa kahigayonan sa huyang nga hydrogen bond;
· Pagpakunhod sa konsentrasyon sa primer – pagpakunhod sa kahigayonan sa paggapos sa sobra nga mga primera ug dili target nga mga rehiyon;
Ubos nga amplification efficiency
Ang kaatbang nga kahimtang sa dili piho nga pagpadako - ubos nga kahusayan sa pagpadako, ug ang mga lakang sa pag-atubang sa ubos nga kahusayan sa pagpadako mao ra ang kaatbang:
· Ilugway ang annealing ug elongation nga panahon;
· Usba ngadto sa tulo ka lakang nga PCR ug pagpakunhod sa annealing temperatura;
· Dugangi ang primerong konsentrasyon;
Ps: Daghang mga gradwado nga mga estudyante nga natawo sa 90s dili gusto nga magtuon kung giunsa ang pag-debug sa mga eksperimento, ug naglaum nga ang kit hingpit nga makasulbad sa problema (kung gusto nimo moadto sa usa ka kompanya nga reagent aron mag-research ug mag-uswag pagkahuman sa gradwasyon), sa tinuud, ang mga tiggama sa reagent usab naghunahuna niini nga paagi, nanghinaut ko nga kini usa ka buang Kini magamit kung makuha nimo kini, mao nga gigastohan ang mga reagent nga mga paningkamot aron masulbad ang daghang mga problema nga dili introduksyon, huyang nga H-bond nga mga hinungdan sa pagsuyup.Aron dali nga masulbad ang problema, ang mga buang kinahanglan pa nga magbasa sa pasiuna sa kompanya sa reagent aron mahibal-an kung adunay hinungdan nga mosuhop sa huyang nga mga bugkos sa hydrogen.
Lisud nga pagpili sa primerong konsentrasyon ug kasamok sa primer-dimer
Pamaagi 1: Sa kinatibuk-an, ang mga instruksyon sa kit para sa qPCR nagrekomendar sa mga sistema ug nagrekomendar sa primerong konsentrasyon.
Pamaagi 2: Pag-debug pinaagi sa pagtakda sa gradient sa konsentrasyon sa primer.Ang hulagway sa ubos gikawat gikan sa usa ka kompanya aron ihulagway.Ang numero sa ubos nagpakita sa fluorescence quantitative resulta nga gihimo uban sa tulo ka primer konsentrasyon gradients (100nM, 250nM, 500nM) ug upat ka template konsentrasyon gradients (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Ang Ct nga kantidad sa mga resulta sa eksperimento giplano sama sa mosunod:

Pagpili sa Primer nga Konsentrasyon Ihugpong ang matag primerong konsentrasyon ngadto sa usa ka linya sama sa mosunod:

Ang pagpili sa primer konsentrasyon mao ang dayag, ang linear nga relasyon sa primer konsentrasyon sa 100nM ug 250nM mao ang mas maayo, ug ang linear nga relasyon sa primer konsentrasyon sa 500nM mao ang medyo kabus.Sa 100nM ug 250nM, ang Ct nga kantidad sa 250nM medyo gamay, busa ang kamalaumon nga konsentrasyon sa primer mao ang 250nM.Kasagaran ang grabe nga primer-dimer makita sa curve sa pagtunaw.Unsa kaha kung ang gidesinyo nga mga primer dili makalikay sa mga primer-dimer?
Pamaagi 3: Bawasan ang gidaghanon sa mga primera ug dugangi ang temperatura sa pag-anil (dili na kinahanglang ipasabot).
Ang empirical nga bili sa annealing temperature mao ang 60°C.Kung dili ka sigurado, unsaon pagpili sa usa ka mas angay nga temperatura sa annealing?Ang tubag parehas sa pagpili sa primerong konsentrasyon -gradient nga pagsulay.Pagkuha og litrato gikan sa kompanya sa Bio-rad aron ihulagway ang problema.Alang sa pagpadako sa usa ka piho nga target nga tipik, ibutang ang walo ka mga gradient sa temperatura, ang matag usa adunay tulo nga pagbalik-balik, ug ang nakuha nga kurba sa amplification mao ang mosunod:

pagpili sa temperatura sa annealing:
·70°C, 69°C—Sa panguna, ang mga primera dili makombinar, mao nga walay amplification.
· 67.3°C – Adunay gamay nga kantidad sa amplification sa sinugdanan, ug ang Ct nga kantidad medyo dako.
·64.5°C——Ang Ct nga kantidad mikunhod.
· Sa 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, ug 55.0°C, ang mga kantidad sa Ct kasagarang lig-on, apan ang katapusang mga bili sa fluorescence lahi.
Unsaon pagpili?Prinsipyo: Ang unang prinsipyo mao ang mas taas nga Ct value.Para sa parehas nga Ct value, pilia ang mas taas nga annealing temperature aron malikayan ang dimerization ug non-specific amplification.Bisan kung adunay mas taas nga kantidad sa fluorescence sa 55 ° C, mahimong adunay mga dimer o dili piho nga pagpadako niini.
Apan kung ikaw sama ka maalamon, siguradong maghunahuna ka: Sa lohikal nga pagsulti, kung ang reaksyon sa PCR espesipiko kaayo, basta ang konsentrasyon sa primer molapas sa minimum nga kinahanglanon, ang taas ug ubos nga mga punto kinahanglan nga walay epekto, sama sa fluorescent dyes ug dNTPs.Sa tinuud, basta ang temperatura sa annealing ma-optimize sa husto, ang epekto sa primer nga konsentrasyon sa kantidad sa Ct natural nga maminusan.

Ang temperatura sa annealing gi-optimize sa husto, ug ang epekto sa primer nga konsentrasyon sa CT maminusan
Ang ikaduha nga istruktura makaapekto sa pagkaayo sa pagpadako
Atong kuhaon ang hulagway gikan sa Bio-rad aron ihulagway ang problema.Nagdisenyo usab kini og gradient sa temperatura aron mapadako ang usa ka gene nga adunay sekondaryang istruktura.

Ang ikaduhang istruktura mitungha
Makita nga samtang ang gradient sa temperatura mikunhod, ang mga produkto nagsugod sa pagpakita ug ang Ct nga bili nagpadayon, nga nakaabot sa minimum nga bili sa 60.7 ° C, ug unya samtang ang temperatura gradient mikunhod, ang Ct nga bili nahimong mas dako.Sa kasukwahi, samtang ang pagtaas sa temperatura, ang ikaduha nga istruktura magbukas ug ang pagkaayo sa pagpadako nagdugang.Human makaabot sa usa ka piho nga temperatura, ang pagtaas sa temperatura dili makapauswag sa pagkaayo sa pagpadako.Tungod kay ang mga primer dili mahimong lig-on nga gihiusa niining panahona.Busa,pangitaa ang temperatura nga adunay labing ubos nga kantidad sa Ct, nga mao ang labing maayo nga temperatura alang sa pagpadako sa ikaduhang istruktura nga template!Siyempre, ang mga maalamon nga buang kinahanglan mahibal-an nga kung dili kinahanglan, labing maayo nga usbon ang mga primera ug likayan ang rehiyon sa sekondaryang istruktura.
5. Ang-ang sa aplikasyon
MIQE—Pagtuki sa Datos

Ang pagtuki sa datos kasagarang gihatag pinaagi sa fluorescent quantitative PCR instrument.Sa miaging artikulo, daghang trabaho sa pag-analisar sa datos ang nahimo, sama sa blangko nga kontrol, nga gipatin-aw sa disenyo sa eksperimento.Giklaro na ang internal reference genes, repeat number, ug uban pa., dinhi kasagaran natong gipatin-aw ang paggamit sa qPCR.
Ang qPCR kaylap nga gigamit, ug ang eksperimento nga pag-verify ug nucleic acid diagnosis mao ang kasagarang gigamit nga mga sitwasyon.
hingpit nga quantification
Ang log (inisyal nga konsentrasyon) adunay linear nga relasyon sa gidaghanon sa mga siklo.Ang usa ka standard nga kurba mahimong makuha gikan sa usa ka sumbanan nga adunay nahibal-an nga inisyal nga numero sa kopya, nga mao, ang linear nga relasyon sa reaksyon sa amplification mahimong makuha.Sumala sa Ct nga kantidad sa sample, ang konsentrasyon sa sample mahimong kalkulado.Ang gidaghanon sa mga templates nga ilakip.

Hingpit nga Quantitative Calculation Method
Ang hingpit nga pag-ihap kinahanglan ibase sa standard curve.Aron makahimo og standard curve, gikinahanglan ang standard.Kasagaran, ang sumbanan usa ka plasmid nga nakuha pinaagi sa pag-clone sa target nga gene.Ngano nga kini usa ka plasmid?Tungod kay ang circular plasmid DNA mao ang labing lig-on.Dilute ang standard nga produkto sa 5 ngadto sa 6 gradients sumala sa pagdoble ratio (10-fold dilution), ug pagtagad sa pagkaparehas sa diha nga diluting.Himoa nga ang kantidad sa Ct mahulog sa taliwala sa 15-30.

Standard nga pagpangandam
Sa samang higayon, ang sample nga sulayan kinahanglan usab nga lasaw sumala niini (hinumdomi ang dilution factor), ug ang Ct value kinahanglan usab nga mahulog sa taliwala sa 15-30.Ang standard nga produkto + ang sample nga sulayan gibutang sa makina nga magkauban.Human sa dagan, usa ka standard curve ang gihimo gamit ang standard substance, ug ang mga sample nga sulayan gidala ngadto sa standard curve aron kuwentahon ang konsentrasyon.
Hepatitis B virus Ang HBV quantification kay usa ka tipikal nga absolute quantification, nga makakalkula sa virus copy number sa 1ml nga dugo.
Pagkalkula sa numero sa kopya
Sample nga konsentrasyon nga sulayan (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
Sample nga gibug-aton sa molekula = gidaghanon sa mga base × 324
Ang numero sa kopya sa sample nga sulayan (mga kopya/ul) = ang konsentrasyon sa sample nga sulayan / ang gibug-aton sa molekula sa sample × 6 × 1014

Pamaagi sa pagkalkula sa numero sa kopya

Ang sa ibabaw mao ang pamaagi sa pagkalkula alang sa pagtino sa gidaghanon.Usa kini ka problema sa matematika nga masulbad human makagradwar sa junior high school, ug ang mga problema sa matematika kasagarang masulbad pinaagi sa mga kompyuter.Kung dili nimo masabtan, mahimo kang moadto aron makigsulti.
relatibong quantification
Ang relatibong quantification kay kasagarang gigamit sa siyentipikong panukiduki.Pila ka mga virus ang anaa sa 1ml sa dugo, ug kini usa ka DNA virus, kini usa ka medyo deterministikong panghitabo: ang gidaghanon sa dugo mahimong matino, ug ang DNA virus medyo lig-on.Bisan pa, lisud alang kanato ang pagtandi sa gidaghanon sa mga kopya sa transkripsyon sa usa ka gene sa usa ka dahon, tungod kay lisud ang pagtino sa gidak-on, gibug-aton, ug kalumo sa dahon, ang gidaghanon sa nakuha nga RNA lisud mahibal-an, ug ang kaepektibo sa reverse transcription lisud usab mahibal-an, sa ato pa, ang bisan unsang lakang mahimo’g maghimo sa mga eksperimento nga datos nga adunay mga bug ug dili magamit.
Busa, ang relatibong quantification kinahanglang magpaila sa usa ka elemento:ang internal nga reference gene.
Sa laing pagkasulti, ang relatibong quantification sa pagkatinuod usa ka pagtandi tali sa target nga gene ug sa internal nga reference gene.Kung itandi sa parehas nga tisyu ug parehas nga cell, ang impluwensya sa gidak-on sa sample, kantidad sa pagkuha sa RNA, reverse transcription efficiency, ug PCR efficiency medyo gamay.Tungod sa gamay nga sampol nga gidak-on, ang mga internal nga reference nga mga gene ug ang target nga mga gene medyo mikunhod.Mao kini ang hinungdan nga atong gipasiugda ang pagkaparehas ug kalig-on kaniadto.
Ang internal nga reference genes kasagaranhousekeeping genes( house-keeping genes), nga nagtumong sa usa ka klase sa mga gene nga lig-on nga gipahayag sa tanan nga mga selula, ug ang ilang mga produkto gikinahanglan aron mapadayon ang batakang mga kalihokan sa kinabuhi sa mga selula.
Ayaw paglibog niini nga konsepto.Ang mga gene sa housekeeping kay biological function terms, samtang ang internal reference genes kay experimental technical terms.Ang housekeeping genes kinahanglang mopasa sa validation sa dili pa kini mapili isip internal reference genes.
Pananglitan, gipili namo ang pipila ka mga gene sa housekeeping sa hulagway sa ubos aron sulayan ang lebel sa ilang ekspresyon sa lain-laing mga selula sa tisyu, ug nakita nga ang lebel sa ekspresyon sa β-2-microglobulin lahi kaayo sa uban nga tulo ka mga gene, mao nga dili kini magamit isip internal reference genes.

Human masabtan ang function sa pagtul-id sa internal reference gene, duha ka algorithm ang nakuha tungod sa pagpaila sa internal reference gene.
· Doble nga standard curve nga pamaagi
·2 – △△Ct nga pamaagi (CT value comparison method)
Kung interesado ka sa pagtuon sa mga espisye ug mga function sa gene, palihug biyai ang panukiduki bahin sa mga algorithm ug gamita ang mga pormula direkta, o direkta nga paggamit sa mga makina;kung ikaw usa ka tarong nga lalaki sa matematika ug engineering, palihug ayaw paglangan.
double standard nga pamaagi sa kurba
I-quantify ang target gene ug housekeeping gene sa control sample ug ang sample nga sulayan pinaagi sa standard curve, ug dayon kuwentaha ang relative value sumala sa calculation formula, nga mao ang relative expression level.
Mga bentaha: yano nga pagtuki, medyo yano nga pag-optimize sa eksperimento
Disbentaha: Alang sa matag gene, ang matag hugna sa mga eksperimento kinahanglang maghimo ug standard curve
Aplikasyon: Usa sa duha nga labing kasagarang gigamit ug giila nga paryente nga quantitative nga mga pamaagi sa pagtuon sa regulasyon sa ekspresyon sa gene
Ang pormula mao ang mosunod:

Ang mga pananglitan mao ang mosunod:

Kalkulahin ang paryente nga kantidad base sa quantitative nga resulta
2 – △△Ct nga pamaagi (CT value comparison method)

Mga bentaha: Dili kinahanglan nga maghimo usa ka standard nga kurba
Mga disadvantages: Gituohan nga ang amplification efficiency duol sa 100%;ang standard deviation mao ang <5%, ug ang standard curve ug ang efficiency tali sa matag amplification gituohan nga makanunayon;ang pag-optimize sa mga kondisyon sa eksperimento mas komplikado.
Aplikasyon: Usa sa duha nga labing kasagarang gigamit ug giila nga paryente nga quantitative nga mga pamaagi sa pagtuon sa regulasyon sa ekspresyon sa gene

Siyempre, ang episyente sa pagpadako kasagarang imposible nga mahimong hingpit 1. Pamaagi sa pagtul-id: Kung nahibal-an naton nga ang target nga gene ug ang reference gene adunay parehas nga kahusayan sa pagpadako, apan ang kahusayan sa pagpadako dili katumbas sa 1, nan ang 2－△△Ct mahimong matul-id ingon: (1 + E ) －△△Ct0lification mahimo nga pormula, kung ang pormula sa lc. 1.95－△△Ct
Sa pagkakaron, ang sulod bahin sa fluorescent quantitative PCR natapos na.